MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화
Summary
이 기사는 1) 초점 접착의 크기와 수 및 2) 세포 형상 지수및 MCF7 세포의 컨런트 단층의 공초점 이미지로부터의 분포를 정량화하는 것을 설명합니다.
Abstract
여기에 제시된 방법은 여러 개의 적절하게 스테인드 된 공초점 이미지에서 컨런트 셀 단층의 일부 매개 변수를 정량화 : 초점 접착의 수와 크기의 함수로 기판에 접착, 및 세포 모양, 세포 모양 인덱스 및 기타 모양 설명자가 특징입니다. 초점 접착은 팍실린 염색에 의해 시각화되었고 세포 세포 경계는 접합 플라코글로빈과 액틴으로 표시되었다. 세포 배양 및 염색 방법에 대한 방법은 표준이었다; 이미지는 단일 초점 평면을 나타냅니다. 이미지 분석은 공개적으로 이용 가능한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 제시된 프로토콜은 단층의 초점 접착력의 수와 크기와 세포 형상 분포의 차이를 정량화하는 데 사용되지만, 염색될 수 있는 다른 뚜렷한 세포 구조의 크기와 형상의 정량화를 위해 재사용될 수 있다(예를 들어, 미토콘드리아 또는 핵). 이러한 매개 변수를 평가하는 것은 세포 모양에 영향을 미치는 세포 접착력 및 actomyosin 수축도를 포함하여 부착 된 세포 층에서 동적 힘의 특성화에 중요합니다.
Introduction
상피 세포 단층은 세포 세포 및 세포 기질 접착뿐만 아니라 수축력 및 장력이 중요한 매개 변수를 나타내고 적절한 균형이 단위1,,2,,3의전반적인 무결성에 기여하는 집단으로서 작용한다. 따라서 이러한 매개 변수를 평가하는 것은 셀 레이어의 현재 상태를 설정하는 방법을 나타냅니다.
여기서 설명된 2개의 방법은 지지체, 상피 세포의 컨런트 단층층의 2차원 분석을 나타낸다(이 경우 MCF7 유방암 세포주). 분석은 Z축의 다른 영역의 공초점 이미지(단일 Z-슬라이스)를 사용하여 수행됩니다. 세포 형상 측정을 위한 초점 접착(FA) 측정 및 정량 영역을 위한 기판 근처의 기저 영역. 제시된 방법은 비교적 간단하며 표준 실험실 기술과 오픈 소스 소프트웨어가 필요합니다. 공초점 현미경 검사는 이 프로토콜에 충분하므로 보다 전문적인 TIRF(총 내부 반사 형광) 현미경 검사를 사용하지 않고 수행할 수 있습니다. 따라서 프로토콜은 비교적 표준 실험실 설정에서 구현될 수 있습니다. 방법의 정확도는 제한적이지만 초점 접착 및 세포 모양의 기본 차이를 구별 할 수 있습니다.
여기서 설명된 두 가지 방법은 ImageJ를 사용하여 수행된 세포 배양, 면역스테인링, 공초점 이미징 및 이미지 분석과 같은 표준 실험 절차로 구성됩니다. 그러나 적절한 기능을 갖춘 모든 이미지 처리 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 제시된 방법은 약리학 처리 또는 최소한의 유전 수정에 의해 가해진 변경을 추적하고 비교할 수 있습니다. 이러한 메서드의 제한된 정밀도로 인해 명확한 값을 얻는 것은 권장되지 않습니다. 많은 이미지의 측정을 용이하게하기 위해 두 개의 자동화 된 매크로가 포함되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 세포 및 세포 기질 접착은 상피 세포의 고유 특성을 구성하고 조직 형태 발생 및 심방 발생에 중요한 역할을한다. 성인 조직에서 세포 층의 기계적 특성의 적절한 조절은 항상성을 유지하고 종양 진행 및 전이와 같은 병리학적 반응을 예방하는 데 중요합니다. 초점 접착의 크기와 수는 세포 기질 접착강도에 따라 달라지며, 세포 모양은 수축력에 따라 다르며 세포-세포 접촉의 상태와 관련이 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 보조금 번호 2014/14/M/NZ1/00437에서 폴란드 국립 과학 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
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