Intratrakeal administrering av tørrpulverformulering hos mus

Summary

Tørrpulverformuleringer for innånding har stort potensial for behandling av luftveissykdommer. Før du går inn i menneskelige studier, er det nødvendig å evaluere effekten av tørrpulverformuleringen i prekliniske studier. En enkel og ikke-invasiv metode for administrering av tørt pulver hos mus gjennom intratrakealruten presenteres.

Abstract

I utviklingen av inhalerbare tørre pulverformuleringer er det viktig å evaluere deres biologiske aktiviteter i prekliniske dyremodeller. Dette papiret introduserer en ikke-invasiv metode for intratrakeal levering av tørrpulverformulering hos mus. En tørr pulverlasteenhet som består av en 200 μL gellastende pipettespiss koblet til en 1 ml sprøyte via en treveis stoppekran presenteres. En liten mengde tørt pulver (1-2 mg) lastes inn i pipettespissen og spres med 0,6 ml luft i sprøyten. Fordi pipettespisser er disponible og rimelige, kan forskjellige tørre pulverformuleringer lastes inn i forskjellige tips på forhånd. Ulike formuleringer kan evalueres i samme dyreforsøk uten rengjøring av enheter og dosepåfylling, og dermed spare tid og eliminere risikoen for krysskontaminering fra restpulver. Omfanget av pulverdispersjon kan inspiseres av mengden pulver som er igjen i pipettespissen. En protokoll for intubasjon i mus med en skreddersydd lyskilde og en veiledende kanyle er inkludert. Riktig intubasjon er en av nøkkelfaktorene som påvirker intratrakeal levering av tørrpulverformulering til musens dype lungeregion.

Introduction

Lungeveien for administrasjon gir ulike fordeler ved å levere terapeutiske behandlinger for både lokale og systemiske handlinger. For behandling av lungesykdommer kan høy lokal legemiddelkonsentrasjon oppnås ved lungelevering, og dermed redusere den nødvendige dosen og redusere forekomsten av systemiske bivirkninger. Videre kan de relativt lave enzymatiske aktivitetene i lungen redusere for tidlig stoffskifte. Lungene er også effektive for legemiddelabsorpsjon for systemisk virkning på grunn av det store og godt perfused overflatearealet, det ekstremt tynne epitelcellelaget og det høye blodvolumet i lungekapillærer¹.

Inhalerte tørrpulverformuleringer har blitt mye undersøkt for forebygging og behandling av ulike sykdommer som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, diabetes mellitus og lungevaksinasjon^2,3,4. Legemidler i fast tilstand er generelt mer stabile enn i flytende form, og tørrpulverinhalatorer er mer bærbare og brukervennlige enn forstøvere^5,6. I utviklingen av inhalerte tørre pulverformuleringer må sikkerheten, den farmakokinetiske profilen og den terapeutiske effekten evalueres i prekliniske dyremodeller etter lungeadministrasjon⁷. I motsetning til mennesker som kan inhalere tørt pulver aktivt, er lungelevering av tørt pulver til små dyr utfordrende. Det er nødvendig å etablere en effektiv protokoll for å levere tørt pulver til lungene til dyr.

Mus er mye brukt som forskningsdyrmodeller fordi de er økonomiske og de avler godt. De er også enkle å håndtere og mange sykdomsmodeller er veletablerte. Det er to store tilnærminger for å administrere tørt pulver til musens lunge: innånding og intratrakeal administrering. For innånding plasseres musen i et helkropps- eller nesekammer der tørt pulver aerosoliseres og dyrene puster inn aerosolen uten sedasjon^8,9. Dyrt utstyr er nødvendig og legemiddelleveringseffektiviteten er lav. Selv om hele kroppskammeret kan være teknisk mindre utfordrende, kan det eneste neseeksponeringskammeret minimere eksponeringen av legemidler til kroppsoverflaten. Uansett er det fortsatt vanskelig å nøyaktig kontrollere og bestemme dosen som leveres til lungene. Det tørre pulveret er hovedsakelig avsatt i nasopharynx-regionen der mucociliary clearance er fremtredende¹⁰. Videre er mus inne i kammeret under betydelig stress under administrasjonsprosessen fordi de er begrenset og fratatt mat og vannforsyning¹¹. For intratrakeal administrering refererer det generelt til innføring av stoffet direkte i luftrøret. Det er to forskjellige teknikker for å oppnå dette: trakeotomi og orotraketisk intubasjon. Førstnevnte krever en kirurgisk prosedyre som gjør et snitt i luftrøret, som er invasiv og sjelden brukt til pulveradministrasjon. Bare den andre teknikken er beskrevet her. Sammenlignet med innåndingsmetoden er intratrakeal administrering den mer brukte metoden for lungelevering i musen på grunn av sin høye leveringseffektivitet med minimalt legemiddeltap^12,13. Det er en enkel og rask metode for å nøyaktig levere en liten mengde pulver i løpet av noen få milligram til musen. Selv om musen er anatomisk og fysiologisk forskjellig fra mennesker og bedøvelse er nødvendig under intubasjonsprosessen, omgår intratrakeal administrering øvre luftveier og tilbyr en mer effektiv måte å vurdere de biologiske aktivitetene til tørrpulverformuleringen som lungeabsorpsjon, biotilgjengelighet og terapeutiske effekter^14,15.

For å administrere tørt pulver intratrakealt, må musen intuberes, noe som kan være utfordrende. I dette papiret er fabrikasjonen av en skreddersydd tørrpulverinsufflator og en intubasjonsenhet beskrevet. Prosedyrene for intubasjon og insufflasjon av tørt pulver i musens lunge er demonstrert.

Protocol

Forsøkene som er utført i denne studien er godkjent av Komiteen for bruk av levende dyr for undervisning og forskning (CULATR), University of Hong Kong. Tørrpulverformuleringer fremstilt ved sprayfrysingstørking (SFD) som inneholder 0,5 % av luciferase messenger RNA (mRNA), 5 % syntetisk peptid PEG12KL4 og 94,5 % av mannitol (m/w) brukes i denne studien til å demonstrere mRNA-uttrykk i lungene16. Mass median aerodynamisk diameter (MMAD) av SFD pulver er 2,4 μm. Spraytørket (SD) m…

Representative Results

Når en tørr pulverinsufflator brukes til å levere pulver aerosol til lungen til et dyr, er volumet av luft som brukes kritisk, da det påvirker sikkerheten så vel som pulverdispersjonseffektiviteten. For å optimalisere metoden ble forskjellige mengder luft (0,3 ml, 0,6 ml og 1,0 ml) brukt til å spre det tørre pulveret (1 mg spraytørket mannitol) og vekten av mus ble overvåket i 48 timer etter administrering (figur 6). Bruken av 0,3 ml og 0,6 ml luft forårsaket ikke vekttap av musen…

Discussion

I dette papiret presenteres skreddersydde enheter for tørrpulverinsufflasjon og intratrakeal intubasjon. I pulverlastingstrinnet lastes tørt pulver inn i en 200 μL gellastende pipettespiss. Det er viktig å trykke forsiktig på spissen for å tillate løs pakking av pulver i den smale enden av spissen. Men hvis pulveret er pakket for tett, vil de sitte fast i spissen og kan ikke spres riktig. Det anbefales å nøytralisere pulverets statiske ladninger og pipettespissen for å lette pulverbelastningen, spesielt for pul…

Materials

BALB/c mouse			Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferase mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Dry Powder Insufflator	PennCentury	Model DP-4M
Ketamine 10%	Alfasan International B.V.	NA
Light emitting diode (LED) torch	Unilite Internation	PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL)	Labcon	1034-800-000
Nylon floss	Reach	30017050
One milliliter syringe without needle	Terumo	SS-01T
Optical fibre	Fibre Data	OMPF1000
PEG12KL4 peptide	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2
Plastic Pasteur fine tip pipette	Alpha Labotatories	LW4061
Three-way stopcock	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.	NA
Zerostat 3 anti-static gun	MILTY	5036694022153