एकल नाभिक अलगाव कोशिका झिल्ली के वियोजन और डिटर्जेंट आधारित परिवर्तन पर निर्भर करता है, ऐसे कदम जिन्हें अनुकूलन की आवश्यकता होती है और तकनीकी कलाकृतियों को पेश करने की संभावना होती है। हम पूरे ऊतक से सीधे बरकरार नाभिक के तेजी से अलगाव के लिए एक डिटर्जेंट और एंजाइम मुक्त प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, जो एकल-नाभिक आरएनए-एसईक्यू (snRNA-Seq) या ATAC-seq के लिए उपयुक्त नाभिक उपज ।
हाई-थ्रूपुट ट्रांसक्रिप्टोम और एपिजेनोम प्रोफाइलिंग के लिए सिंगल सेल या सिंगल न्यूक्लियी सस्पेंशन तैयार करने की जरूरत होती है । बरकरार कोशिका या नाभिक के साथ निलंबन की तैयारी में वियोजन और पारमेबिलाइजेशन शामिल है, ऐसे कदम जो अवांछित शोर और अवांछनीय क्षति को पेश कर सकते हैं। विशेष रूप से, कुछ सेल-प्रकार जैसे न्यूरॉन्स व्यक्तिगत कोशिकाओं में अलग-अलग होना चुनौतीपूर्ण हैं। इसके अतिरिक्त, नाभिक को छोड़ने के लिए सेलुलर झिल्ली के पारमेबिलाइजेशन को परीक्षण और त्रुटि द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली, श्रम गहन और आर्थिक रूप से अव्यवहार्य हो सकती है। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए नमूना तैयारी की मजबूती और प्रजनन क्षमता को बढ़ाने के लिए, हम एक रैपिड एंजाइम और डिटर्जेंट-मुक्त कॉलम-आधारित नाभिक अलगाव विधि का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल 20 मिनट के भीतर पूरे जेब्राफिश मस्तिष्क से नाभिक के कुशल अलगाव को सक्षम बनाता है। अलग नाभिक प्रदर्शन बरकरार परमाणु आकृति विज्ञान और कुल करने के लिए कम प्रवृत्ति । इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री नाभिक संवर्धन और डाउनस्ट्रीम आवेदन के लिए सेलुलर मलबे की निकासी की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल, जो नरम ऊतकों और सुसंस्कृत कोशिकाओं पर काम करना चाहिए, नमूना तैयारी के लिए एक सरल और सुलभ विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग उच्च थ्रूपुट प्रोफाइलिंग के लिए किया जा सकता है, सफल एकल-नाभिक आरएनए-एसईक्यू और ATAC-seq प्रयोगों के लिए आवश्यक कदमों को सरल बनाता है।
एकल सेल आरएनए-एसईक्यू (स्क्रर्ना-सेक़) और एटीसी-सेक्यू एकल-कोशिका संकल्प पर जटिल जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए बहुमुखी उपकरण हैं। वे व्यापक रूप से सेल उपप्रकारों और राज्यों, जीन नेटवर्क को परिभाषित करने और सेलुलर विषमता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । स्क्रर्ना-सेक्यू प्रदर्शन के लिए एक शर्त ऊतक वियोजन द्वारा एकल कोशिका निलंबन की तैयारी है। एक्सेरसेलुलर मैट्रिक्स संरचना और यांत्रिक गुणों में भिन्नता के कारण, व्यक्तिगत ऊतकों को एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए वियोजन प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
एकल कोशिकाओं में ऊतकों के वियोजन में आमतौर पर पाचन एंजाइमों के साथ उपचार शामिल होता है, जिसमें कोलेजन, डिस्पास,या ट्राइप्सिन, 37 डिग्री सेल्सियस1,,2,,3,4पर होता है। चूंकि ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय रहती है, इसलिए एंजाइमेटिक वियोजन एमआरएनए अभिव्यक्ति कलाकृतियों और शोर5,,6को पेश कर सकता है। विशेष रूप से, लंबे समय तक इनक्यूबेशन तनाव उत्तरदायी जीन और गर्मी-सदमे प्रतिक्रिया को गैर-समान तरीके से प्रेरित कर सकती है – जिससे प्रयोग7में तकनीकी परिवर्तनशीलता हो सकती है।
एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने की एक और खामी जटिल मॉर्फोलोजी के साथ व्यवहार्य और अक्षुण्ण कोशिका-प्रकार प्राप्त करने में कठिनाई है। विशेष रूप से, न्यूरॉन्स, एडिपोसाइट्स और पोडोसाइट्स,8, 9,10, 11को अलग करना चुनौतीपूर्ण हैं।,9,11 उदाहरण के लिए, वू और उनके सहयोगियों ने एक वयस्क माउस किडनी12से स्क्रर्ना प्रोफाइल में ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स की अनुपस्थिति का प्रदर्शन किया। मस्तिष्क के ऊतकों 8 , 13,,14से परस्पर न्यूरॉन्स की वसूली के संबंध में इसी13तरहकी गैर – ऑप्टिमल टिप्पणियां की गई हैं . संक्षेप में, वियोजन प्रोटोकॉल सेल-प्रकारों को अलग करने के लिए आसान दिशा में पता लगाने पूर्वाग्रह शुरू कर सकते हैं, जिससे अंग के सेलुलर वास्तुकला का गलत बयानी हो सकता है।
स्क्रर्ना-सेक्यू में नमूना तैयारी के दौरान पेश किए गए तकनीकी शोर और पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए, नाभिक को अलगाव और प्रोफाइलिंग एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है। चूंकि परमाणु आकृति विज्ञान विभिन्न कोशिका-प्रकारों के बीच समान है, इसलिए नाभिक का अलगाव जटिल मॉर्फोलोजी के साथ अक्षुण्ण और व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग-थलग करने के मुद्दे को दरकिनार करता है। उदाहरण के लिए, वू और उनके सहयोगियों ने एक वयस्क माउस किडनी के एकल-नाभिक आरएनए-सेक्यू (snRNA-Seq.) के साथ ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स की सफल प्रोफाइलिंग का प्रदर्शन किया, जो scRNA-Seq12से गायब था । दिलचस्प बात यह है कि एकल कोशिका और एकल नाभिक आरएनए-एसईक्यू के बीच तुलनात्मक अध्ययनों ने एसएनएनए-सेक्यू12के साथ तनाव और हीट-शॉक रिस्पांस जीन को शामिल करने में कमी का सुझाव दिया है । अध्ययन आगे दो तरीकों से पता चला जीन के बीच एक उच्च संबंध का सुझाव देते हैं । हालांकि, मानव माइक्रोग्लिया पर हाल ही में एक अध्ययनअल्जाइमर रोग 15में आनुवंशिक सक्रियण का पता लगाने में विफल रहा । इस प्रकार कुछ संदर्भों में, snRNA-Seq scRNA-Seq16, 17,17के लिए एक उपयुक्त विकल्प है । इसके अतिरिक्त, परमाणु अलगाव का उपयोग एकल-कोशिका ATAC-Seq के लिए किया जा सकता है, जो व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर खुले क्रोमेटिन के क्षेत्रों के बारे में जानकारी प्रदान करता है।
नाभिक अलगाव के लिए प्रोटोकॉल में नाभिक को छोड़ने के लिए कोशिका झिल्ली के तीन प्रमुख कदम शामिल हैं: i) डिटर्जेंट आधारित लाइसिस; ii) डोउंस होमोजेनाइजर का उपयोग करके ऊतक समरूपता; और iii) नाभिक का संवर्धन और ढाल अपकेंद्रित्र या प्रवाह साइटोमेट्री 18 ,19, 20,,,21,,22का उपयोग कर सेल मलबे को हटाने।18 इसमें से, पहले दो चरण ऊतक प्रकार पर निर्भर करते हैं और अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित होने की आवश्यकता है। हल्के डिटर्जेंट से कोशिका झिल्ली का आंशिक टूटना होता है और23के ऊतकों से नाभिक की अक्षम पुनः प्राप्ति होती है । दूसरी ओर, डिटर्जेंट और कठोर समरूपता के उच्च स्तर से परमाणु झिल्ली टूट जाती है और उनका नुकसान24,,25हो जाता है । उठी नाभिक आगे एक साथ झुरमुट और समुच्चय बनाते हैं, जिसे यदि नहीं हटाया जाता है तो डाउनस्ट्रीम प्रोफाइलिंग प्रयोग में कलाकृतियों का कारण बन सकता है।
नाभिक अलगाव के लिए डिटर्जेंट अनुकूलन से संबंधित मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हम एक डिटर्जेंट मुक्त और स्पिन-कॉलम-आधारित विधि का उपयोग करके ताजा नमूनों से बरकरार नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। प्रोटोकॉल 20 मिनट के भीतर पूरे अंग से नाभिक पैदा करता है, जो विरूपण साक्ष्य प्रतिलेखन के प्रेरण को सीमित करता है। अलग नाभिक एकल नाभिक आरएनए-Seq. और ATAC-seq के लिए FACS के साथ समृद्ध किया जा सकता है, एक सरल और सार्वभौमिक विधि है कि मजबूत और प्रजनन उच्च थ्रूपुट प्रोफाइलिंग सक्षम बनाता है प्रदान करते हैं ।
एक एकल कोशिका संकल्प पर ट्रांसक्रिप्टोम और एपिगेनोम प्रोफाइलिंग ने जैविक प्रणालियों के अध्ययन में क्रांतिकारी बदलाव किया है। एक ठोस ऊतक के लिए एक एकल कोशिका के संकल्प पर अध्ययन अलग-अलग कोशिकाओं या नाभिक में अंग के वियोजन पर निर्भर करता है। वियोजन एक विनाशकारी प्रक्रिया है जो तकनीकी कलाकृतियों को पेश कर सकती है, जो सिस्टम5,,6के सटीक प्रतिनिधित्व के विकास को रोक सकती है। उदाहरण के लिए, एंजाइमेटिक वियोजन जटिल मॉर्फोलोजी, जैसे न्यूरॉन्स या पोडोसाइट्स के साथ कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है, और तनाव और गर्मी-सदमे प्रतिक्रिया जीन7,,12की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, वियोजन के दौरान डिटर्जेंट का उपयोग परमाणु झिल्ली को टूट सकता है और एकत्रीकरण23, 25,तक लेजासकता है। इस प्रकार, उच्चतम गुणवत्ता के एकल कोशिका या नाभिक निलंबन प्राप्त करने के लिए वियोजन का अनुकूलन उच्च-थ्रूपुट प्रोफाइलिंग प्रयोगों की सफलता के लिए सर्वोपरि है।
यहां, हम एक डिटर्जेंट और एंजाइम मुक्त नाभिक अलगाव विधि प्रदर्शित करते हैं जो 20 मिनट से भी कम समय में जेब्राफिश मस्तिष्क से बरकरार नाभिक को निकालने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल ठेठ आकृति विज्ञान और मजबूत अखंडता(चित्रा 2)के साथ नाभिक पैदावार । 6 मिलीग्राम वजनी एक जेब्राफिश मस्तिष्क से, प्रोटोकॉल एक हीमोसाइटोमीटर गिनती द्वारा निर्धारित कुल 60,000 नाभिक की पैदावार करता है। अलग नाभिक का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें snrna-seq, ATAC-seq और इम्यूनोदाता शामिल हैं। अलग नाभिक में साइटोप्लाज्मिक अंशों से क्रॉस-संदूषण शामिल हो सकता है, विशेष रूप से एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और माइटोकॉन्ड्रिया के घटकों से। उच्च थ्रूपुट प्रोफाइलिंग प्रयोगों के लिए, सेलुलर मलबे, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रिया की निकासी की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। फ्लो साइटोमेट्री(चित्र 3)नाभिक के शुद्धिकरण के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, मलबे को हटाने के लिए सुक्रोज ढाल का भी उपयोग किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल माउस थायराइड ग्रंथि (डेटा नहीं दिखाया गया है) पर परीक्षण किया गया है और ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क ऊतक के समान परिणाम प्रदान करता है । कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल एकल नाभिक निलंबन की तैयारी के लिए एक मजबूत, प्रजनन योग्य और सार्वभौमिक विधि प्रदान करता है, जो उच्च-थ्रूपुट प्रोफाइलिंग प्रयोगों के लिए रसद को सरल बनाने में मदद करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए डॉ सबीन कोस्टाग्लिओला और सिंह लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । इस काम को ग्रांट नंबर 34772792 – एमआईएसयू से एसपीएस के तहत शौकीन्स डे ला रिचेचेस्के Scientifique-FNRS द्वारा समर्थित किया गया था।
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |