Enkeltkjerner isolasjon er avhengig av dissosiasjon og vaskemiddel-basert permeabilisering av cellemembranen, trinn som trenger optimalisering og er utsatt for å innføre tekniske artefakter. Vi demonstrerer et vaskemiddel og enzymfri protokoll for rask isolering av intakte kjerner direkte fra hele vev, noe som gir kjerner egnet for enkeltkjerne RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.
Transkripsjon av høy gjennomstrømning og epigenomprofilering krever fremstilling av en enkelt celle eller enkelt kjernesuspensjon. Utarbeidelse av suspensjon med intakt celle eller kjerner innebærer dissosiasjon og permeabilisering, trinn som kan introdusere uønsket støy og uønsket skade. Spesielt er visse celletyper som nevroner utfordrende å ta avstand til individuelle celler. I tillegg krever permeabilisering av cellulær membran for å frigjøre kjerner optimalisering ved prøving og feiling, noe som kan være tidkrevende, arbeidsintensiv og økonomisk ikke levedyktig. For å forbedre robustheten og reproduserbarheten til prøveforberedelsen for sekvensering av høy gjennomstrømning, beskriver vi en rask enzym- og vaskemiddelfri kolonnebasert isolasjonsmetode for kjerner. Protokollen muliggjør effektiv isolering av kjerner fra hele sebrafiskhjernen innen 20 minutter. De isolerte kjerner viser intakt kjernefysisk morfologi og lav tilbøyelighet til å aggregere. Videre, flow cytometri tillater kjerneberikelse og klaring av cellulære rusk for nedstrøms bruk. Protokollen, som skal fungere på bløtvev og kultiverte celler, gir en enkel og tilgjengelig metode for prøveforberedelse som kan brukes til høygjennomstrømningprofilering, noe som forenkler trinnene som kreves for vellykkede enkeltkjerne RNA-seq- og ATAC-seq-eksperimenter.
Encellede RNA-seq (scRNA-Seq) og ATAC-seq er allsidige verktøy for å studere komplekse biologiske systemer ved encellet oppløsning. De er mye brukt til å definere celleundertyper og stater, gennettverk og for å vurdere cellulær heterogenitet. En forutsetning for å utføre scRNA-seq er utarbeidelsen av en enkelt cellesuspensjon ved vevsdissosiasjon. På grunn av variasjonen i den ekstracellulære matrisesammensetningen og mekaniske egenskaper, krever individuelle vev optimalisering av dissosiasjonsprotokollen for fremstilling av enkeltcellesuspensjon.
Dissosiasjon av vev i enkeltceller innebærer vanligvis behandling med fordøyelsesenzymer, inkludert kollagenasje, dispase eller trypsin, ved 37 °C1,,2,,3,,4. Som transkripsjonsmaskiner forblir aktive ved 37 °C, kan enzymatisk dissosiasjon introdusere mRNA-uttrykksartefakter og støy5,,6. Spesielt kan langvarig inkubasjon indusere stressresponsive gener og varmesjokkrespons på en ikke-ensartet måte – noe som fører til teknisk variasjon i eksperimentet7.
En annen ulempe med å generere en enkelt celle suspensjon er vanskeligheten med å skaffe levedyktige og intakte celletyper med komplekse morfologier. Spesielt er nevroner, adicytter og podocytes utfordrende å isolere8,9,10,11. For eksempel viste Wu og kolleger fraværet av glomerulære podocytes i scRNA-profiler fra en voksen mus nyre12. Lignende ikke-til-noen observasjoner er gjort om utvinning av sammenkoblede nevroner fra hjernevev8,13,14. I sum kan dissosiasjonsprotokoller introdusere deteksjonsbias mot lettere å dissosiere celletyper, noe som fører til en feilaktig fremstilling av organets cellulære arkitektur.
For å overvinne den tekniske støyen og skjevheten som ble introdusert under prøveforberedelse i scRNA-Seq., gir isolasjon og profilering av kjernen et attraktivt alternativ. Som kjernefysisk morfologi er lik mellom forskjellige celletyper, omgår isolasjon av kjernene spørsmålet om å isolere intakte og levedyktige celler med komplekse morfologier. For eksempel demonstrerte Wu og kolleger vellykket profilering av glomerulære podocytes med single-nucleus RNA-Seq. (snRNA-Seq.) av en voksen mus nyre, som manglet fra scRNA-Seq12. Spennende, komparative studier mellom encellede og enkjerne RNA-seq har antydet en reduksjon i induksjon av stress og varmesjokk respons gener med snRNA-Seq12. Studiene tyder videre på en høy korrelasjon mellom genene som oppdages av de to metodene. Imidlertid klarte en nylig studie på menneskelig mikroglia ikke å oppdage genetisk aktivering i Alzheimers sykdom15. Dermed i visse sammenhenger, er snRNA-Seq et egnet alternativ for scRNA-Seq16,17. I tillegg kan kjernefysisk isolasjon brukes for encellede ATAC-Seq., som gir informasjon om regionene for åpen kromatin i individuelle celler.
Protokollen for nuklei isolasjon innebærer tre hovedtrinn: i) vaskemiddelbasert lysis av cellemembran for å frigjøre kjernen; ii) vev homogenisering ved hjelp av en Dounce homogenisator; og iii) berikelse av kjerner og fjerning av celleavfall ved hjelp av gradient sentrifugering eller strømning cytometri18,,19,,20,,21,,22. Blant dette er de to første trinnene avhengig av vevstypen og må empirisk optimaliseres. Mildt vaskemiddel fører til delvis brudd på cellemembran og ineffektiv gjenfinning av kjerner fra vevet23. På den annen side fører høyt nivå av vaskemiddel og hard homogenisering til brudd på atommembranen og deres tap24,25. Sprukket kjerner har videre en tendens til å klumpe seg sammen og danne aggregater, noe som hvis ikke fjernes kan føre til gjenstander i nedstrøms profileringseksperimentet.
For å omgå problemene knyttet til rengjøringsmiddeloptimalisering for nukleisolasjon, introduserer vi en protokoll for å isolere intakte kjerner fra friske prøver ved hjelp av en vaskemiddelfri og spin-kolonnebasert metode. Protokollen gir kjerner fra hele orgelet innen 20 minutter, noe som begrenser induksjonen av artefaktiv transkripsjon. De isolerte kjernene kan berikes med FACS for single-nuclei RNA-Seq. og ATAC-seq, noe som gir en enkel og universell metode som muliggjør robust og reproduserbar høygjennomstrømningprofilering.
Profilering av transkripsjons- og epigenomet ved en enkeltcelleoppløsning har revolusjonert studien av biologiske systemer. Studier ved oppløsning av en enkelt celle for et solid vev avhenger av dissosiasjon av orgelet i individuelle celler eller kjerner. Dissosiasjon er en destruktiv prosedyre som kan introdusere tekniske gjenstander, noe som kan forhindre utvikling av en nøyaktig representasjon av systemet5,6. For eksempel kan enzymatisk dissosiasjon skade celler med komplekse morfologier, for eksempel nevroner eller podocytes, og kan indusere uttrykk for stress og varmesjokkrespons gener7,12. I tillegg kan bruk av vaskemiddel under dissosiasjon bryte atommembranen og føre til aggregering23,25. Dermed er optimalisering av dissosiasjonen for å oppnå en enkelt celle eller kjernesuspensjon av høyeste kvalitet avgjørende for suksessen til høygjennomstrømningprofileringseksperimenter.
Her demonstrerer vi en vaskemiddel- og enzymfri nukleiisolasjonsmetode som gjør det mulig å ekstrare nytte av intakte kjerner fra sebrafiskhjernen på mindre enn 20 minutter. Protokollen gir kjerner med typisk morfologi og robust integritet (figur 2). Fra en enkelt sebrafisk hjerne som veier 6 mg, gir protokollen totalt 60.000 kjerner bestemt av et hemocytometer antall. De isolerte kjernene kan brukes til flere nedstrømsapplikasjoner, inkludert snRNA-seq, ATAC-seq og immunostaining. De isolerte kjernene kan omfatte krysskontaminering fra cytoplasmatiske fraksjoner, spesielt fra komponenter av endoplasmisk retikulem og mitokondrier. For høygjennomstrømning profilering eksperimenter, clearance av cellulære rusk, spesielt mitokondrier, anbefales sterkt. Flow cytometri (figur 3) gir et levedyktig alternativ for rensing av kjerner. Alternativt kan sukrosegradienten også benyttes for fjerning av rusk.
Protokollen har blitt testet på mus skjoldbruskkjertelen (data ikke vist) og gir resultater som ligner på sebrafisk hjernevev. Samlet sett gir protokollen en robust, reproduserbar og universell metode for utarbeidelse av enkeltkjernesuspensjon, noe som bidrar til å forenkle logistikken for profileringseksperimenter med høy gjennomstrømning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Dr. Sabine Costagliola og Singh lab for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS under Grant nummer 34772792 – MISU til S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |