هنا هو وسيلة للتحقيق في أدوار Na+/ K+ مضخة ومستمرة Na+ الحالية في interneurons القلب باستخدام المشبك الديناميكي.
وNa+/ K+ مضخة, غالبا ما يعتقد من كدالة خلفية في نشاط الخلايا العصبية, يساهم التيار الخارجي (أنامضخة) التي تستجيب للتركيز الداخلي من نا+ ([نا+]أنا). في انفجار الخلايا العصبية, مثل تلك الموجودة في مولد نمط مركزي (CPG) الشبكات العصبية التي تنتج الحركات الإيقاعية, [نا+]أنا، وبالتالي أنامضخة, يمكن أن يتوقع أن تختلف طوال دورة انفجار. هذه الاستجابة للنشاط الكهربائي ، جنبا إلى جنب مع الاستقلال عن إمكانات الأغشية ، وهبت أناضخ مع خصائص ديناميكية ليست شائعة في التيارات القائمة على القناة (على سبيل المثال ، الجهد أو أجهزة الإرسال بوابات أو تسرب القنوات). وعلاوة على ذلك، في العديد من الخلايا العصبية، يتم تعديل نشاط المضخة من قبل مجموعة متنوعة من المغيرات، وزيادة توسيع الدور المحتمل أننيضخ في النشاط الانفجار الإيقاعي. هذه الورقة تبين كيفية استخدام مزيج من النمذجة وطرق المشبك الديناميكي لتحديد كيفية ضخ وتفاعلها مع ناالمستمرة + النشاط الإيقاعي التأثير الحالي في CPG. على وجه التحديد ، ستركز هذه الورقة على بروتوكول المشبك الديناميكي وطرق النمذجة الحسابية في الطفيليات القلبية من ال علقات طبية.
ويقود ضربات القلب في الشقوق من قبل CPG تتكون من 9 أزواج ثنائية من interneurons القلب (HNs) موزعة عبر العديد من العقدة نصف الجسم مجزأة. في قلب CPG هي أزواج مثبطة للطرفين من interneurons تقع في3 rd و4 العقدة القطاعية التي تشكل مذبذبات نصف المركز (HCOs) (الشكل 1A). هذه الخلايا العصبية تستمر في الانفجار عندما معزولة بشكل متشابك الدوائية باستخدام بيكوكلين1. البعض الآخر، مثل الزوج في العقدة القطاعية7 (محور هذا البروتوكول)، هي أيضا الانفجارات، وقادرة على إنتاج النشاط انفجار عندما معزولة متشابك. فهي ليست متصلة بشكل متبادل وتتلقى مدخلات تنازلية فقط ، وبالتالي يتم عزلها بسهولة عن طريق قطع العقدة عن بقية الحبل العصبي. هذا النشاط انفجار مستقلة حساسة لإدخال تسرب التيار الناجم عن الاختراق مع microelectrodes حادة للتسجيل ولكن انفجر بقوة عندما سجلت مع طرق التصحيحفضفاضة 1.
وقد تم على غرار كل من الخلايا العصبية HN الفردية وHHN HCOs (هودجكين-هكسلي القائم على نماذج مقصورة واحدة متساوية الوعاء من الخلايا العصبية HN التي تحتوي على جميع التيارات ذات بوابات الجهد متشابك حددت تجريبيا)، وجميع خصائص انفجار النظام الحي قد استولت بنجاح2. Myomodulin، وهو الببتيد العصبي الذاتية في الكراث، يقلل بشكل ملحوظ من الفترة (T) من إيقاع انفجار الخلايا العصبية HN معزولة وHCOs HN. هذا المغير يعمل على زيادة ح الحالية (فرط الاستقطاب تنشيط التيار الداخلي، وأناح) وانخفاض أناضخ3. أدت هذه الملاحظة إلى استكشاف كيفية ضخ يتفاعل مع Ih، وكيف يساهم التعديل المشترك في النشاط الإيقاعي للخلايا العصبية HN. تفعيل المضخة عن طريق زيادة [Na+]ط (باستخدام monensin ionophore) بسرعة إيقاع انفجار HN في كل من HCOs HN والخلايا العصبية HN معزولة4. وكان هذا الإسراع تعتمد على Ih. عندما تم حظر ح (2 MM CS+)، لم يتم تغيير فترة الانفجار من قبل هذه الطريقة من تنشيط المضخة. ومع ذلك، تم تقليص مدة انفجار (دينار) ، والفاصل الزمني بين الانفجار (IBI) زيادة في كل من HCOs HN والخلايا العصبية HN معزولة4.
لهذا البروتوكول، يتم دمج جميع التيارات من الخلايا العصبية HN المعيشة (7)، بما في ذلك مضخة الحالية، وأنامضخة،في نموذج HN على النحو التالي:
(1)
حيث C هو سعة الغشاء (في nF)، V هو احتمال الغشاء (في V)، ر هو الوقت (في ق). وقد وصفت الأوصاف والمعادلات الأيونية الحالية مفصلة في مكان آخر2،4. كامل HN نموذج الخلايا العصبية يعمل في الوقت الحقيقي (الشكل 2). سيتم توفير البرنامج على GitHub عند نشره وسيكون مناسبا للعمل على لوحة معالجة الإشارات الرقمية الموضحة في جدول المواد. هنا ، فإن محور التحقيق هو Na+/ K+ مضخة التيار (أنامضخة) والتيارات ذات بوابات الجهد المساهمة كبيرة نا+ تدفق : نا سريع+ الحالية (أنانا) ومستمرة نا+ الحالية (أناف). التوصيلات القصوى لهذه التيارات
هي على التوالي. وNa+/ K+ مضخة التبادلات ثلاثة داخل الخلية Na+ الأيونات لاثنين من خارج الخلية K+ الأيونات، وبالتالي إنتاج تيار صافي إلى الخارج. الأهم من ذلك، فإنه يضخ 3 أضعاف نا+ من الخلايا العصبية كما يشير هذا التيار، وهو أمر مهم لحساب Na داخل الخلية+ التركيز.
يعتمد تيار المضخة Na+K+ على تركيزات Na+ داخل الخلية ويتم التعبير عنه من خلال الدالة السينية التالية:
(2)
حيث [نا]أنا هو داخل الخلية Na+ التركيز، هو أقصى نا+/ ك+ مضخة الحالية، [Na]ih هو Naداخل الخلية + تركيز لنصف تنشيط Na+/ K+ مضخة، و [Na]هو حساسية Na+/ K+ مضخة إلى [Na]i. [Na]أنا يبني نتيجة للنا+ التدفقات التي يحملها أناP وأنا نا ويتناقص من قبل Na+ efflux من Na+/ K+ مضخة. مساهمة أنا ح وأناتسرب إلى مجموع Na+ تدفق صغيرة ولا يعتبر في النموذج في الوقت الحقيقي.
(3)
حيث، v هو حجم (~ 6.7 pL) من خزان Na+ داخل الخلية، F هو ثابت فاراداي، ويتم الاحتفاظ بتركيز Na+ خارج الخلية ثابتا.
وقد تم التفريق بين التيارات ذات بوابات الجهد وتسرب هذه الاستجابة لإمكانات الغشاء – من تيار المضخة، الذي ينظمه Na داخل الخليةمحسوبة + تركيز ([Na+]i). [نا+] أنا تراكمت من خلال Na+ الدخول عبر نا سريع+ الحالي (أنانا) التي تنتج إمكانات العمل (المسامير) وناالمستمرة + الحالية ( IP) التي توفر إزالة الاستقطاب لدعم spiking. [نا+] أنا ، بدوره ، خفضت من خلال عمل المضخة من خلال البثق من نا+. وقد افترض القيم HN المعيشة خط الأساس من (5nS) و
(150 nS)، ونحن نأخذ في الاعتبار أي المشبك الديناميكي المضافة
.
الهدف من البروتوكول الموصوف هنا هو التلاعب أناضخ بدقة وعكسي في الوقت الحقيقي لاكتشاف كيف يتفاعل مع التيارات ذات بوابات الجهد (ناالمستمرة + الحالية في البروتوكول الحالي) للسيطرة على الانفجار الإيقاعي في HNs واحد. ولتحقيق هذا الهدف، تم استخدام المشبك الديناميكي، الذي يقدم بشكل مصطنع، بناء على الأمر، كمية دقيقة من أي تيار يمكن حسابه أثناء تشغيل النموذج. هذه الطريقة لها مزايا على التلاعب الدوائي للمضخة ، والتي تؤثر على الأنسجة بأكملها ، يمكن أن يكون لها آثار خارج الهدف التي غالبا ما يصعب عكسها ، ولا يمكن التلاعب بها بدقة. المشبك الديناميكي5،6 يقرأ الجهد من الخلايا العصبية المسجلة في الوقت الحقيقي ( الشكل1B) ويحسب ويحقن ، في الوقت الحقيقي ، ومقدار أي تيار على أساس معادلات النموذج والقيم المحددة لأي أو
. ويمكن بسهولة تطبيق أساليب مماثلة على أي الخلايا العصبية التي يمكن تسجيلها داخل الخلايا. ومع ذلك، يجب إعادة قياس المعلمات إلى الخلايا العصبية المختارة، وينبغي عزل الخلايا العصبية من المدخلات متشابك، على سبيل المثال، الدوائية.
النمذجة، المشبك الديناميكي، والتحليلات الناتجة التي تمكنها هي تقنيات مفيدة لاستكشاف كيفية مساهمة الفرد والمجموعات من التوصيل الأيونية / التيارات في النشاط الكهربائي للخلايا العصبية (الشكل 1، الشكل 2،الشكل 4، والشكل 5). استخدام هذه التقنيات يبين كيف Na+/ K+ مضخة الحالية (أنامضخة) يتفاعل مع التيارات ذات بوابات الجهد، ولا سيما المستمر Na+ الحالية (IP)، لتعزيز انفجار قوي في نمط ضربات القلب الرئيسية HNs مولد. من خلال الجمع بين التجارب المشبك الديناميكي والنمذجة، فمن الممكن لاختبار نماذج بشكل مباشر أكثر مما هو ممكن مع تسجيل الجهد العادي وتقنيات المشبك الحالية. النتائج التي تم جمعها من التجارب المشبك الديناميكي(الشكل 5)وسوف تستخدم لزيادة صقل نموذج HN. يمكن تخصيص الطريقة الأساسية لقط ديناميكية أظهرت هنا لتعكس خصائص أي خلية عصبية قيد الدراسة إذا كان يمكن تحديد نموذج رياضي من التيارات العصبية مع التجارب المشبك الجهد.
يتطلب الانتهاء الناجح من تجارب النوع الموضح هنا طعنا دقيقا ل HN أو خلية عصبية أخرى عند استخدام microelectrode حاد ، لأن الانفجار القوي يتم تقليصه عن طريق اختراق القطبالكهربائي 1. (تقنيات تسجيل التصحيح الخلية الكاملة، والتي تقلل من تسرب أدخلت، تنطبق أيضا على الخلايا العصبية الأخرى، ولكن لا تعمل بشكل جيد على الخلايا العصبية علقة.) ومن الأهمية بمكان أن التشوه من الخلايا العصبية HN يسبب الحد الأدنى من الضرر للخلية العصبية (تسرب المضافة), وينبغي رصد مقاومة المدخلات ويجب أن تكون في حدود 60-100 MOhms للتجارب الناجحة4.
المشبك الديناميكي هو تقنية قوية ، ولكن لديها قيود تفرضها هندسة الخلايا العصبية لأن التوصيلات الاصطناعية يتم تنفيذها في موقع القطب التسجيل – عادة جسم الخلية – ليس في الموقع الذي عادة ما تكون فيه التيارات المولدة للإيقاع مترجمة5،6،10. في الخلايا العصبية HN, جسم الخلية هو كهربائيا قريبة من منطقة التكامل (neurite الرئيسي) من الخلايا العصبية حيث يتم توطين معظم التيارات النشطة, وتبدأ المسامير.
The authors have nothing to disclose.
نشكر كريستيان Erxleben للتجارب الأولية المشبك الديناميكي على HN (7) الخلايا العصبية التي أظهرت قدراتها انفجار. ساعدت أنجيلا وينينج التجارب بنصيحة الخبراء. ونحن نعترف المعاهد القومية للصحة لتمويل هذا العمل من خلال منحة 1 R21 NS111355 إلى GSC وRLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |