这里介绍了一种使用动态夹子在水痘心脏内膜中研究 Na+/K+ 泵和持久 Na+ 电流的作用的方法。
Na+/K+泵通常被认为是神经元活动的背景功能,它贡献了一个向外电流(I泵), 对 Na= ([Na]i)的内部浓度做出响应。在突发神经元中,如在产生节奏运动的中央模式发生器 (CPG) 神经元网络中发现的神经元中,[Na]i,因此 I泵,可以预期在整个爆发周期中会有所不同。这种对电活动的响应,加上独立于膜电位,赋予I泵具有基于通道电流(例如电压或发射器门控或泄漏通道)所不常见的动态特性。此外,在许多神经元中,泵的活动由各种调制剂调节,进一步扩大了I泵在有节奏的爆裂活动中的潜在作用。本文展示了如何使用建模和动态夹合方法的组合来确定我如何泵及其与持久 Na 的相互作用–电流影响 CPG 中的节奏活动。具体来说,本文将重点研究药用水痘心脏内膜的动态夹紧协议和计算建模方法。
水痘的心跳是由一个CPG驱动的,由9对双边心脏内膜(HNs)组成,分布在尽可能多的中体段性结节中。CPG 的核心是位于第 3 和第 4段的内窥孔相互抑制对,它们形成半中心振荡器 (HCOs) (图 1A)。这些神经元继续爆裂时,突触分离药理使用双胆碱1。其他的,如第7段结节(本协议的重点)中的对,也是爆裂器,能够在突触隔离时产生爆裂活动。它们不是相互连接的,只接收下降输入,因此很容易通过切断神经线的其余部分来隔离结石。这种独立的爆裂活动是敏感的引入泄漏电流造成的渗透与尖锐的微电极记录,但大力爆裂时,记录与松散的补丁方法1。
单个HN神经元和HNHCO都经过了建模(霍奇金-赫克斯利基于HN神经元的单等能隔间模型,包含所有实验确定的电压门和突触电流),并且已经成功地捕获了活系统的所有爆发特征2。肌霉素是水痘中的内源性神经肽,可显著降低分离的HN神经元和HNHCOs的爆发节律的周期(T)。这种调制剂的作用是增加H电流(超极化激活的内电流,Ih)和减少我泵3。这一观察导致探索我泵如何与Ih相互作用,以及它们的相互调制如何有助于HN神经元的节奏活动。通过增加[Na]i (使用离子酚莫宁辛) 来激活泵,在 HN HCOs 和分离的 HN 神经元4中加快 HN 爆发节律。这种加速取决于我h.当我h被阻塞 (2 mM Cs+),爆裂期没有改变这种泵激活方法:然而,爆发持续时间(BD)被缩短,在HNHCOs和分离的HN神经元4的爆发间隔(IBI)增加。
对于此协议,活HN(7)神经元的所有电流,包括泵电流 ,I泵,都纳入HN模型如下:
(1)
其中C是膜电容(在nF),V是膜电位(在V),t是时间(在s)。详细的离子电流描述和方程已经描述了其他地方2,4。完整的HN模型神经元实时运行(图2)。该软件将在GitHub上发布,并适合在材料表中描述的数字信号处理板上运行。在这里,查询的焦点是 Na+/K+泵电流(I泵) 和电压门电流贡献显著的 Na+通量: 快速纳+电流(INa) 和持久纳+电流(IP)。这些电流的最大导电性
分别为。Na=/K=泵交换三个细胞内 Na=离子,交换两个细胞外 K=离子,从而产生净外流。重要的是,它泵出的神经元是当前指示的3倍,这对计算细胞内Na的浓度很重要。
Na+/K= 泵电流取决于细胞内 Na= 浓度,并通过以下阴性函数表示:
(2)
其中[Na]i 是细胞内 Na=浓度, 是最大 Na=/K=泵电流, [Na]ih是细胞内 Na=浓度为 Na+/K=泵的半激活, [Na]是Na=/K=泵对[Na]i的敏感性。[Na]i 生成由于IP和INa携带的 Na+流入, 并被 Na+ /K+泵的 Na+efflux 减少。Ih和我泄漏对总 Na+通量的贡献很小,在实时模型中不考虑。
(3)
其中,v 是细胞内 Na+ 水库的体积 (+6.7 pL),F 是法拉第的常数,细胞外 Na= 浓度保持不变。
电压门和泄漏导电已区分 – 这些对膜电位的反应 – 从泵电流,这是由计算的细胞内 Na=浓度 ([Na]i)调节。[娜]我通过 Na+条目通过快速 Na+电流(iNa)建立起来, 产生行动潜力 (尖峰) 和持久的 Na+电流(IP),提供去极化, 以支持尖峰。[娜]反过来,我通过Na的挤出,泵的动作减少了。已假设基线活HN值 (5nS) 和
(150 nS), 我们考虑任何添加的动态夹
。
此处描述的协议的目标是实时精确和可逆地操作I泵,以发现它如何与电压门电流(当前协议中的持久 Na+电流)相互作用,以控制单个 HN 中的节奏爆裂。为了实现这一目标,使用了动态夹子,在命令下人为地引入任何电流的精确量,这些电流可以根据模型运行情况进行计算。这种方法比影响整个组织的泵的药理操作具有优势,具有偏离目标的效果,通常难以逆转,而且无法精确操纵。动态夹子5,6实时读取记录神经元的电压 (图 1B),并实时计算和注入任何电流的量基于模型方程和任何 或
.类似的方法可以很容易地应用于任何神经元,可以记录在细胞内。但是,参数必须重新缩放到所选的神经元,并且神经元应从突触输入中分离出来,例如,在药理学上。
建模、动态夹子以及由此产生的分析是探索离子传导/电流个体和组对神经元电活动的有用技术(图1、图2、图4和图5)。这些技术的使用显示了 Na+/K+泵电流(I泵) 如何与电压门电流(尤其是持久 Na+电流(IP)相互作用,以促进水痘心跳模式发生器核心 HN 的强力爆裂。通过结合动态夹子实验和建模,可以比普通电压记录和电流夹技术更直接地测试模型。从动态夹子实验(图5)中收集的结果将用于进一步完善HN模型。如果可以通过电压夹实验确定神经元电流的数学模型,可以定制此处演示的动态夹紧的基本方法,以反映所研究的任何神经元的特性。
成功完成此处显示的类型实验需要在使用锐利的微电极时小心刺穿HN或其他神经元,因为电极穿透1会抑制强爆裂。(全细胞贴片记录技术,尽量减少引入泄漏,也适用于其他神经元,但对水痘神经元效果不好。至关重要的是,HN神经元的刺穿对神经元(增加泄漏)造成的损害最小,输入电阻应进行监测,并且必须在60-100 MOhms范围内才能成功进行实验4。
动态夹子是一种强大的技术,但它有神经元几何学施加的限制,因为人工传导是在记录电极的部位(通常是细胞体)实施的,而不是在节奏生成电流通常局部化为 5、6、10的部位。在水痘HN神经元中,细胞体在电学上接近神经元的整合区(主神经质),其中大多数活性电流被定位,并且尖峰被启动。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢克里斯蒂安·埃尔克斯莱本对HN(7)神经元的初步动态夹子实验,这些神经元展示了它们的爆发能力。安吉拉·温宁在专家建议下协助实验。我们感谢 NIH 通过向 GSC 和 RLC 提供赠款 1 R21 NS111355 为这项工作提供资金。
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |