Præsenteret her er en metode til undersøgelse af rollerne i Na+/ K+ pumpen og vedvarende Na+ strøm i igle hjerte interneurons ved hjælp af dynamisk klemme.
Na+/K+ pumpen, ofte tænkt som en baggrundsfunktion i neuronal aktivitet, bidrager med en udadgående strøm (jegpumpe),der reagerer på den interne koncentration af Na+ ([Na+]i). I sprængning neuroner, som dem, der findes i centrale mønster generator (CPG) neuronale netværk, der producerer rytmiske bevægelser, [Na+]i og derfor Ipumpe, kan forventes at variere i hele burst cyklus. Denne reaktionsevne over for elektrisk aktivitet, kombineret med uafhængighed fra membran potentiale, begave jegpumpe med dynamiske egenskaber ikke fælles for kanalbaserede strømme (f.eks spænding- eller sender-gated eller lækage kanaler). Desuden er pumpens aktivitet i mange neuroner moduleret af en række modulatorer, hvilket yderligere udvider den potentielle rolle, som jegpumper i rytmisk sprængaktivitet. Dette papir viser, hvordan man bruger en kombination af modellering og dynamisk klemme metoder til at bestemme, hvordan jegpumpe og dens interaktion med vedvarende Na+ nuværende indflydelse rytmiske aktivitet i en CPG. Specifikt vil dette papir fokusere på en dynamisk klemme protokol og beregningsmæssige modellering metoder i hjertet interneurons af medicinske igler.
Heartbeat i igler er drevet af en CPG bestående af 9 bilaterale par hjerte interneurons (HNs) fordelt på så mange mid-body segmentale ganglier. Kernen i CPG er gensidigt hæmmende par interneurons placeret i 3rd og 4th segmentale ganglier, der danner halv-center oscillatorer (HCOs) (Figur 1A). Disse neuroner fortsætter med at briste, når synaptisk isolerede farmakologisk ved hjælp af bikukulin1. Andre, såsom parret i 7th segmentale ganglier (fokus i denne protokol), er også bursters, i stand til at producere sprængning aktivitet, når synaptisk isoleret. De er ikke indbyrdes forbundne og modtager kun faldende input, og dermed er let isoleret ved at afskære ganglion fra resten af nerveledningen. Denne uafhængige sprængningsaktivitet er følsom over for indført lækagestrøm forårsaget af penetration med skarpe mikroelektroder til optagelse, men kraftigt bristet, når den registreres med løse patchmetoder1.
Både individuelle HN neuroner og HN HCOs er blevet modelleret (Hodgkin-Huxley-baserede enkelt isopotential rum modeller af HN neuroner, der indeholder alle eksperimentelt identificeret spænding-gated og synaptiske strømme), og alle de bristede egenskaber af det levende system er blevet med succes fanget2. Myomodulin, en endogen neuropeptid i igler, markant nedsætter perioden (T) af burst rytme isolerede HN neuroner og HN HCOs. Denne modulator virker til at øge h-strøm (hyperpolarisering-aktiveret indadgående strøm, jegh)og at mindske jegpumpe3. Denne observation førte til udforskning af, hvordan jegpumpe interagerer med Ih, og hvordan deres co-graduering bidrager til den rytmiske aktivitet af HN neuroner. Aktivering af pumpen ved at øge [Na+]i (ved hjælp af ionophore monensin) hastigheder HN burst rytme i både HN HCOs og isolerede HN neuroner4. Denne fremskyndelse var afhængig af Ih. Da jegh blev blokeret (2 mM Cs+), blev burst periode ikke ændret ved denne metode til pump aktivering; bristeperioden (BD) blev dog begrænset, og pauseintervallet (IBI) steg i både HN HCOs og isolerede HN-neuroner4.
For denne protokol, alle strømme af en levende HN (7) neuron, herunder pumpen strøm, jegpumpe, er indarbejdet i HN model som følger:
(1)
hvor C er membranen kapacitans (i nF), V er membranpotentialet (i V), t er tid (i s). Detaljerede ioniske aktuelle beskrivelser og ligninger er blevet beskrevet andetsteds2,4. Den komplette HN-model neuron kører i realtid (Figur 2). Softwaren vil blive gjort tilgængelig på GitHub ved offentliggørelse og vil være egnet til at køre på det digitale signalbehandlingsbræt, der er beskrevet i materialetabellen. Her er fokus for undersøgelsen er Na+/ K+ pumpestrøm(jegpumpe)og spænding-gated strømme bidrager betydelige Na+ flux: en hurtig Na+ strøm (INa) og en vedvarende Na+ strøm (IP). De maksimale ledningsninger af disse strømme er
henholdsvis. Na+/K+ pumpen udveksler tre intracellulære Na+ ioner for to ekstracellulære K+ ioner, hvilket producerer en nettoudstrøm. Vigtigere er det, det pumper 3 gange så meget Na+ ud af neuron som denne strøm indikerer, hvilket er vigtigt for beregning af intracellulære Na+ koncentration.
Na+/K+ pumpestrømmen afhænger af intracellulære Na+ koncentrationer og udtrykkes ved følgende sigmoidale funktion:
(2)
hvor [Na]i er den intracellulære Na+ koncentration, er den maksimale Na+/ K+ pumpestrøm, [Na]ih er den intracellulære Na+ koncentration for halvaktivering af Na+/ K+ pumpen, og [Na]er følsomheden af Na+/ K+ pumpen til [Na]i. [Na]Jeg bygger som et resultat af Na+ tilstrømningen båret af IP og INa og er formindsket af Na+ efflux af Na+/ K+ pumpen. Bidraget fra Ih og jegLeak til den samlede Na+ flux er lille og er ikke overvejet i realtid model.
(3)
hvor v er volumen (~ 6,7 pL) af intracellulære Na+ reservoir, F er Faraday’s konstant, og den ekstracellulære Na+ koncentration holdes konstant.
Spændingsafledninger og lækageledninger er blevet differentieret – disse reagerer på membranpotentialet – fra pumpestrømmen, som reguleres af den beregnede intracellulære Na+-koncentration ([Na+]i). [Na+] Jeg er bygget op gennem Na+ post via den hurtige Na+ strøm(INa),der producerer handling potentialer (pigge) og den vedvarende Na+ strøm(IP),der giver depolarisering til støtte spiking. [Na+] Jeg er igen reduceret ved virkningen af pumpen gennem ekstrudering af Na+. Baseline levende HN værdier af (5nS) og
(150 nS) er blevet antaget, og vi tager hensyn til enhver ekstra dynamisk klemme
.
Målet med den protokol, der er beskrevet her, er at manipulere jegpumpe præcist og reverably i realtid for at opdage, hvordan det interagerer med spænding-gated strømme (vedvarende Na+ strøm i den nuværende protokol) for at kontrollere rytmisk sprængning i enkelt HNs. For at nå dette mål blev dynamisk klemme brugt, som kunstigt introducerer, ved kommando, en præcis mængde af enhver strøm, der kan beregnes som modellen kører. Denne metode har fordele i forhold til farmakologisk manipulation af pumpen, som påvirker hele vævet, kan have off-target effekter, der ofte er svære at vende, og kan ikke manipuleres præcist. Dynamisk klemme5,6 læser spændingen af en registreret neuron i realtid ( Figur1B) og beregner og injicerer i realtid mængden af enhver strøm baseret på model ligninger og de fastsatte værdier af en eller
. Lignende metoder kan let anvendes på enhver neuron, der kan registreres intracellulært. Parametrene skal dog omskaleres til den valgte neuron, og neuronen skal isoleres fra synaptiske input, f.eks. farmakologisk.
Modellering, dynamisk klemme og de resulterende analyser, de muliggør, er nyttige teknikker til at undersøge, hvordan individ og grupper af ionisk ledning /strøm bidrager til neuronernes elektriske aktivitet (Figur 1, Figur 2,Figur 4og Figur 5). Brugen af disse teknikker viser, hvordan Na+/ K+ pumpestrøm(jegpumpe)interagerer med spænding-gated strømme, især den vedvarende Na+ strøm (IP),at fremme robust sprængning i igle hjerteslag mønster generatorens kerne HNs. Ved at kombinere dynamiske klemmeforsøg og modellering er det muligt at teste modeller mere direkte end muligt med almindelig spændingsregistrering og strømklemmeteknikker. Resultaterne indsamlet fra de dynamiske klemmeforsøg (Figur 5) vil blive brugt til yderligere at forfine HN-modellen. Den grundlæggende metode til dynamisk fastspænding demonstreret her kan tilpasses til at afspejle egenskaberne af enhver neuron under undersøgelse, hvis en matematisk model af neuronale strømme kan bestemmes med spænding klemme eksperimenter.
Vellykket afslutning af eksperimenter af den type, der vises her, kræver omhyggelig impalementering af en HN eller anden neuron, når du bruger en skarp mikroelektrode, fordi stærk sprængning begrænses af elektrodeindtrængning1. (Helcelle patch optagelse teknikker, som minimerer indført lækage, gælder også for andre neuroner, men fungerer ikke godt på igle neuroner.) Det er afgørende, at impalementering af HN neuron forårsager minimal skade på neuronen (tilsat lækage), og inputresistens skal overvåges og skal være i intervallet 60-100 MOhms for vellykkede eksperimenter4.
Dynamisk klemme er en kraftfuld teknik, men det har begrænsninger pålagt af neuronal geometri, fordi de kunstige ledningsninger er implementeret på stedet for optagelsen elektrode-normalt cellen kroppen-ikke på det sted, hvor rytme-genererende strømme er normalt lokaliseret5,6,10. I igle HN neuroner, cellelegemet er elektrisk tæt på integration zone (vigtigste neurite) af neuron, hvor de fleste aktive strømme er lokaliseret, og pigge er indledt.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christian Erxleben for indledende dynamiske klemme eksperimenter på HN(7) neuroner, der viste deres sprængning kapaciteter. Angela Wenning hjalp eksperimenterne med ekspertrådgivning. Vi anerkender NIH for at finansiere dette arbejde gennem Grant 1 R21 NS111355 til GSR og RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |