Présenté ici est une méthode d’étude des rôles de la pompe Na+/ K+ et du courant Na+ persistant dans les interneurones cardiaques de sangsue à l’aide d’une pince dynamique.
La pompe Na+/K+, souvent considérée comme une fonction de fond dans l’activité neuronale, contribue à un courant extérieur(pompeI)qui répond à la concentration interne de Na+ ([Na+]i). Dans les neurones en éclatement, tels que ceux trouvés dans les réseaux neuronaux du générateur de motifs centraux (CPG) qui produisent des mouvements rythmiques, on peuts’attendre à ce que la pompe [Na+] i et donc la pompeI varient tout au long du cycle de rafale. Cette réactivité à l’activité électrique, combinée à l’indépendance par rapport au potentiel membranaire, confère à lapompe I des propriétés dynamiques qui ne sont pas communes aux courants basés sur des canaux (par exemple, des canaux à tension ou à émetteur ou de fuite). De plus, dans de nombreux neurones, l’activité de la pompe est modulée par une variété de modulateurs, ce qui élargit encore le rôle potentiel de la pompe I dans l’activité d’éclatement rythmique. Cet article montre comment utiliser une combinaison de méthodes de modélisation et de pince dynamique pour déterminer comment jepompe et son interaction avec le courant Na+ persistant influencent l’activité rythmique dans un CPG. Plus précisément, cet article se concentrera sur un protocole de serrage dynamique et des méthodes de modélisation informatique dans les interneurones cardiaques des sangsues médicinales.
Le rythme cardiaque dans les sangsues est entraîné par un CPG composé de 9 paires bilatérales d’interneurones cardiaques (HN) répartis sur autant de ganglions segmentaires du milieu du corps. Au cœur du CPG se trouvent des paires mutuellement inhibitrices d’interneurones situés dans les ganglions3e et4 e segmentaires qui forment des oscillateurs demi-centraux (HCO)(Figure 1A). Ces neurones continuent d’éclater lorsqu’ils sont isolés pharmacologiquement synaptiquement à l’aide de la bicuculline1. D’autres, comme la paire dans les ganglions du 7e segment (le centre de ce protocole), sont également des éclateurs, capables de produire une activité d’éclatement lorsqu’ils sont isolés synaptiquement. Ils ne sont pas mutuellement connectés et ne reçoivent que des entrées descendantes, et sont donc facilement isolés en coupant le ganglion du reste du cordon nerveux. Cette activité d’éclatement indépendante est sensible au courant de fuite introduit causé par la pénétration avec des microélectrodes pointues pour l’enregistrement, mais éclate vigoureusement lorsqu’il est enregistré avec des méthodes de patch lâche1.
Les neurones HN individuels et les HPO HN ont été modélisés (modèles de compartiment isopotentiel unique basés sur Hodgkin-Huxley de neurones HN contenant tous les courants voltage-gated et synaptiques identifiés expérimentalement), et toutes les caractéristiques de sursaut du système vivant ont été capturées avec succès2. La myomoduline, un neuropeptide endogène dans les sangsues, diminue considérablement la période (T) du rythme d’éclatement des neurones HN isolés et des HPO HN. Ce modulateur agit pour augmenter le courant h (courant intérieur activé par hyperpolarisation, Ih)et pour diminuer lapompeI3. Cette observation a conduit à l’exploration de la façon dont Ipump interagit avec Ih,et comment leur co-modulation contribue à l’activité rythmique des neurones HN. L’activation de la pompe en augmentant [Na+]i (à l’aide de l’ionophore monensine) accélère le rythme de l’éclatement HN dans les HCO HN et les neurones HN isolés4. Cette accélération dépendait de Ih. Lorsque Ih était bloqué (2 mM Cs+),la période d’éclatement n’était pas altérée par cette méthode d’activation de la pompe; cependant, la durée de l’éclatement (BD) a été réduite et l’intervalle d’interrafale (IBI) a augmenté à la fois dans les HPO HPO et les neurones HN isolés4.
Pour ce protocole, tous les courants d’un neurone HN(7) vivant, y compris le courant de pompe, pompeI,sont incorporés dans le modèle HN comme suit :
(1)
où C est la capacité membranaire (en nF), V est le potentiel membranaire (en V), t est le temps (en s). Des descriptions et des équations détaillées du courant ionique ont été décritesailleurs 2,4. Le neurone du modèle HN complet fonctionne en temps réel (Figure 2). Le logiciel sera disponible sur GitHub dès sa publication et pourra fonctionner sur la carte de traitement du signal numérique décrite dans la Table des matériaux. Ici, l’objet de la recherche est le courant de pompe Na+/ K+ (pompeI)et les courants voltage-fermés contribuant à un flux Na+ significatif: un courant Na+ rapide (INa) et un courant Na+ persistant (IP). Les conductances maximales de ces courants sont
respectivement. La pompe Na+/K+ échange trois ions Na+ intracellulaires contre deux ions K+ extracellulaires, produisant ainsi un courant net vers l’extérieur. Il est important de souligner qu’il pompe 3 fois plus de Na+ hors du neurone que ce courant l’indique, ce qui est important pour calculer laconcentration intracellulaire de Na +.
Le courant de pompe Na+/K+ dépend des concentrations intracellulaires de Na+ et est exprimé par la fonction sigmoïdale suivante:
(2)
où [Na]i est la concentration intracellulaire de Na+, est le courant maximal de la pompe Na+/K +, [Na]ih est la concentration intracellulaire de Na+ pour la demi-activation de la pompe Na+/K+, et [Na]est la sensibilité de la pompe Na+/K+ à [Na]i. [Na]i se construit à la suite des apports Na+ transportés par IP et INa et est diminué par l’efflux Na+ de la pompe Na+/K+. La contribution de Ih et ILeak au flux total de Na+ est faible et n’est pas prise en compte dans le modèle en temps réel.
(3)
où, v est le volume (~6,7 pL) du réservoir intracellulaire Na+, F est la constante de Faraday et la concentration extracellulaire Na+ est maintenue constante.
Les conductances voltage-fermées et les conductances de fuite ont été différenciées – elles répondent au potentiel membranaire – à partir du courant de la pompe, qui est régulé par la concentration intracellulaire Na+ calculée ([Na+]i). [Na+] i est construit par l’entrée Na+ via le courant rapide Na+ (INa)qui produit des potentiels d’action (pics) et le courant Persistant Na+ (IP) qui fournit la dépolarisation pour soutenir le pic. [Na+] i est, à son tour, réduit par l’action de la pompe par l’extrusion de Na+. Des valeurs de HN vivantes de base de (5nS) et
(150 nS) ont été supposées, et nous tenons compte de toute pince dynamique
ajoutée.
Le but du protocole décrit ici est de manipuler lapompe I de manière précise et réversible en temps réel pour découvrir comment elle interagit avec les courants voltage-fermés (courant Na+ persistant dans le protocole actuel) pour contrôler l’éclatement rythmique dans les HNs simples. Pour atteindre cet objectif, une pince dynamique a été utilisée, qui introduit artificiellement, sur commande, une quantité précise de tout courant pouvant être calculé au fur et à mesure que le modèle est en cours d’exécution. Cette méthode présente des avantages par rapport à la manipulation pharmacologique de la pompe, qui affecte l’ensemble du tissu, peut avoir des effets hors cible qui sont souvent difficiles à inverser et ne peut pas être manipulée avec précision. La pince dynamique5,6 lit la tension d’un neurone enregistré en temps réel(Figure 1B)et calcule et injecte, en temps réel, la quantité de tout courant en fonction des équations du modèle et des valeurs définies de tout ou
. Des méthodes similaires peuvent facilement être appliquées à n’importe quel neurone qui peut être enregistré intracellulairement. Cependant, les paramètres devront être redimensionnés en fonction du neurone choisi et le neurone devra être isolé des entrées synaptiques, par exemple pharmacologiquement.
La modélisation, la pince dynamique et les analyses qui en résultent sont des techniques utiles pour explorer comment les conducteurs/courants ioniques individuels et les groupes contribuent à l’activité électrique des neurones(Figure 1, Figure 2,Figure 4et Figure 5). L’utilisation de ces techniques montre comment le courant de pompe Na+/ K+ (pompeI)interagit avec les courants voltage-fermés, en particulier le courant Persistant Na+ (IP),pour favoriser un éclatement robuste dans les HNs de base du générateur de pulsation de sangsue. En combinant des expériences de serrage dynamique et de modélisation, il est possible de tester des modèles plus directement qu’avec des techniques ordinaires d’enregistrement de tension et de pince de courant. Les résultats obtenus à partir des expériences de serrage dynamique(figure 5) serontutilisés pour affiner davantage le modèle HN. La méthode de base de serrage dynamique démontrée ici peut être personnalisée pour refléter les propriétés de n’importe quel neurone étudié si un modèle mathématique des courants neuronaux peut être déterminé avec des expériences de pince de tension.
La réussite des expériences du type montré ici nécessite un empalement minutieux d’un HN ou d’un autre neurone lors de l’utilisation d’une microélectrode pointue, car un fort éclatement est réduit par la pénétration de l’électrode1. (Les techniques d’enregistrement de patch de cellules entières, qui minimisent les fuites introduites, sont également applicables à d’autres neurones, mais ne fonctionnent pas bien sur les neurones de sangsue.) Il est essentiel que l’empalement du neurone HN cause un minimum de dommages au neurone (fuite supplémentaire), et la résistance d’entrée doit être surveillée et doit être comprise entre 60 et 100 MOhms pour des expériences réussies4.
La pince dynamique est une technique puissante, mais elle a des limites imposées par la géométrie neuronale car les conductances artificielles sont mises en œuvre sur le site de l’électrode d’enregistrement – généralement le corps cellulaire – et non sur le site où les courants générateurs de rythme sont généralement localisés5,6,10. Dans les neurones HN de sangsue, le corps cellulaire est électriquement proche de la zone d’intégration (neurite principale) du neurone où la plupart des courants actifs sont localisés et où des pics sont initiés.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Christian Erxleben pour les premières expériences de serrage dynamique sur les neurones HN(7) qui ont démontré leurs capacités d’éclatement. Angela Wenning a aidé les expériences avec des conseils d’experts. Nous reconnaissons les NIH pour le financement de ce travail par le biais de la subvention 1 R21 NS111355 à GSC et RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |