מוצג כאן היא שיטה לחקירה של התפקידים של Na+/ K+ משאבה מתמשכתNa + הנוכחי ineurons לב עלוקה באמצעות מלחציים דינמיים.
משאבת Na+/ K+ , הנחשבת לעתים קרובות כפונקציית רקע בפעילות העצבית, תורמת זרם חיצוני (Ipump) המגיב לריכוז הפנימי של Na+ ([Na+]i). בנוירונים מתפוצצים, כגון אלה שנמצאו ברשתות עצביות של מחולל דפוסים מרכזי (CPG) המייצרות תנועות קצביות, ניתן לצפות שמשאבתה- I [Na+] ולכן משאבת I תשתנה לאורך מחזור ההתפרצות. היענות זו לפעילות חשמלית, בשילוב עם עצמאות מפוטנציאל הממברנה, מעניקה לימשאבה עם תכונות דינמיות שאינן נפוצות בזרמים מבוססי ערוץ (למשל, ערוצי מתח או משדר מגודרים או דליפה). יתר על כן, בנוירונים רבים, פעילות המשאבה מווסתתת על ידי מגוון של אפננים, מה שמרחיב עוד יותר את התפקיד הפוטנציאלי של אנישואב בפעילות מתפרצת קצבית. מאמר זה מראה כיצד להשתמש בשילוב של מודלים ושיטות הידוק דינמיות כדי לקבוע כיצד אנימשאבה ואת האינטראקציה שלה עם Na+ פעילות קצבית השפעה נוכחית מתמשכת ב- CPG. באופן ספציפי, מאמר זה יתמקד בפרוטוקול מהדק דינמי ושיטות מידול חישוביות בלב פנימי של עלוקות רפואיות.
פעימות לב בעלוקות מונעות על ידי CPG המורכב מ-9 זוגות דו-צדדיים של אינטראורונים לב (HNs) המופצים על פני גרעינים מגזריים בינוניים רבים. בליבת ה-CPG נמצאים זוגות מעכבים הדדית של אינטראורונים הממוקמים בגרעיניהחלק השלישי וה-4 המהווים מתנדים חצי-מרכזיים (HCOs)(איור 1A). נוירונים אלה ממשיכים להתפוצץ כאשר מבודדים באופן סינפטי באמצעות bicuculline1. אחרים, כגון הזוג בגרעיניהמגזרי 7 (המוקד של פרוטוקול זה), הם גם מתפרצים, המסוגלים לייצר פעילות מתפרצת כאשר מבודדים באופן סינפטי. הם אינם מחוברים זה לזה ומקבלים רק קלט יורד, ולכן מבודדים בקלות על ידי ניתוק הגנגליון משאר חוט העצבים. פעילות מתפרצת עצמאית זו רגישה לזרם הדליפה שהוכנס שנגרם על ידי חדירה עם מיקרו-ectrodes חד להקלטה אך מתפוצצת במרץ כאשר היא מוקלטת בשיטות תיקון רופף1.
הן נוירוני HN בודדים והן HN HCOs עוצבו (מודלים של תא איזופוטנציאלי יחיד מבוסס הודג’קין-האקסלי של נוירוני HN המכילים את כל הזרמים המגודרים והסינפטיים שזוהו באופן ניסיוני), וכל מאפייני הפרץ של המערכת החיה נתפסו בהצלחה2. מיומודולין, נוירופפטיד אנדוגני בעלוקות, מקטין באופן משמעותי את התקופה (T) של קצב הפרץ של נוירונים HN מבודדים ו- HN HCOs. אפנון זה פועל כדי להגדיל את זרם h (היפר-קוטביות מופעל זרם פנימה, אניh) כדי להקטין אנימשאבה3. תצפית זו הובילה לחקירה של איך אנימשאבה אינטראקציה עם Ih, וכיצד אפנון המשותף שלהם תורם לפעילות הקצבית של נוירונים HN. הפעלת המשאבה על ידי הגדלת [Na+]i (באמצעות מונסין ionophore) מאיצה את קצב פרץ HN הן HCOs HN נוירונים HN מבודדים4. האצה זו הייתה תלויה ב- ih. כאשר נחסמתי (2 מ”מ צלז צלזיון+), תקופת הפרץ לא שונתה בשיטה זו של הפעלת המשאבה; עם זאת, משך הפרץ (BD) צומצם, ומרווח הבין-גזעי (IBI) גדל הן ב- HN HCOs והן בנוירונים מבודדיםHN 4.
עבור פרוטוקול זה, כל הזרמים של נוירון HN(7) חי, כולל זרם המשאבה, אנימשאבה, משולבים במודל HN כדלקמן:
(1)
כאשר C הוא קיבוליות הממברנה (ב- nF), V הוא פוטנציאל הממברנה (ב- V), t הוא זמן (ב s). תיאורים ומשוואות זרם יוני מפורטים תוארו במקום אחר2,4. נוירון הדגם המלא של דגם HN פועל בזמן אמת(איור 2). התוכנה תהיה זמינה על GitHub עם הפרסום ויהיה מתאים לרוץ על לוח עיבוד האות הדיגיטלי המתואר בטבלת החומרים. כאן, מוקד החקירה הוא זרם Na+/ K+ משאבה (אנימשאבה) ואת הזרמים מגודר מתח תורם משמעותי Na+ שטף: זרם Na+ מהיר (INa) ו זרם Na+ מתמשך (IP). ההולכות המקסימליות של זרמים אלה הן
בהתאמה. Na+/ K+ משאבה מחליף שלושה Na תאי+ יונים עבור שני K חוץ תאי+ יונים, ובכך לייצר זרם חיצוני נטו. חשוב לציין, הוא שואב 3 פעמים Na+ מתוך הנוירון כפי שזרם זה מציין, אשר חשוב לחישוב Naתאי + ריכוז.
זרם המשאבה Na+/K+ תלוי בריכוזים תאיים של Na+ והוא בא לידי ביטוי על ידי הפונקציה הסיגמוידלית הבאה:
(2)
כאשר [Na]i הוא נה תאי+ ריכוז, הוא מקסימום Na+/ K+ משאבה הנוכחי, [Na]ih הוא נה תאי+ ריכוז עבור חצי הפעלה של Na+/ K+ משאבה, ו [Na]הוא הרגישות של Na+/ K+ משאבה ל [Na]i. [Na]אני בונה כתוצאה של Na+ זרם נישא על ידי IP ואני Na והוא פחת על ידי Na+ שפכים של Na+/ K+ משאבה. התרומה של Ih ואנידולף סך Na+ שטף הוא קטן ולא נחשב במודל בזמן אמת.
(3)
שבו, v הוא הנפח (~ 6.7 pL) של המאגר Na+ תאי תאי, F הוא הקבוע של פאראדיי, ואת נה+ ריכוז חוץ תאי נשמר קבוע.
מוליכות מגודרות מתח ודליפות הובחנו – אלה מגיבים לפוטנציאל הממברנה – מזרם המשאבה, המוסדר על ידי ריכוז Na+ תאי מחושב ([Na+]i). [נה+] i בנוי דרך Na+ כניסה באמצעות זרם Na+ מהיר (INa) המייצר פוטנציאל פעולה (קוצים) ואת זרם Na+ מתמשך (IP) המספק את depolarization כדי לתמוך spiking. [נה+] אני, בתורו, מופחת על ידי הפעולה של המשאבה דרך שחול של Na+. ערכי HN חיים בסיסיים של (5nS) ו
– (150 nS) הונחו, ואנו לוקחים בחשבון כל מהדק דינמי נוסף
.
מטרת הפרוטוקול המתואר כאן היא לתמרן אנילשאוב בדיוק והפכה בזמן אמת כדי לגלות כיצד הוא אינטראקציה עם זרמים מגודרים מתח (זרם Na+ מתמשך בפרוטוקול הנוכחי) כדי לשלוט פרץ קצבי ב- HNs יחיד. כדי להשיג מטרה זו, נעשה שימוש במצדק דינמי, אשר מציג באופן מלאכותי, על הפקודה, כמות מדויקת של כל זרם שניתן לחשב כמו המודל פועל. לשיטה זו יש יתרונות על פני מניפולציה פרמקולוגית של המשאבה, המשפיעה על הרקמה כולה, יכול להיות השפעות מחוץ למטרה כי הם לעתים קרובות קשה להפוך, ולא ניתן מניפולציה מדויקת. מהדק דינמי5,6 קורא את המתח של נוירון מוקלט בזמן אמת ( איור1B) ומחשב ומזריק, בזמן אמת, את כמות כל זרם המבוסס על משוואות מודל ואת הערכים שנקבעו של כל או
. שיטות דומות ניתן ליישם בקלות על כל נוירון שניתן להקליט תאיים. עם זאת, פרמטרים יצטרכו להיות rescaled הנוירון שנבחר, ואת הנוירון צריך להיות מבודד תשומות סינפטיות, למשל, פרמקולוגית.
מידול, מהדק דינמי והניתוחים המתקבלים שהם מאפשרים הם טכניקות שימושיות לחקר האופן שבו יחידים וקבוצות של מוליכות/זרמים יוניים תורמים לפעילות החשמלית של תאי העצב (איור 1, איור 2,איור 4 ואיור 5). השימוש בטכניקות אלה מראה כיצד זרם Na+/K+ pump (Ipump) מקיים אינטראקציה עם זרמים מגודרים במתח, במיוחד זרם Na+ המתמשך (IP), כדי לקדם התפרצות חזקה ב- HNs הליבה של מחולל פעימות הלב של עלוקה. על ידי שילוב של ניסויי מלחציים דינמיים ודוגמנות, ניתן לבחון מודלים באופן ישיר יותר מהאפשרי עם הקלטת מתח רגילה וטכניקות מהדק זרם. התוצאות שנאספו מניסויי המלחציים הדינמיים (איור 5) ישמשו כדי לחדד עוד יותר את מודל ה-HN. השיטה הבסיסית של הידוק דינמי המודגם כאן ניתן להתאים אישית כדי לשקף את המאפיינים של כל נוירון תחת מחקר אם מודל מתמטי של זרמים עצביים ניתן לקבוע עם ניסויי מלחצי מתח.
השלמה מוצלחת של הניסויים מהסוג המוצג כאן דורשת שיפוד זהיר של HN או נוירון אחר בעת שימוש במיקרואלקטרודה חדה, מכיוון שהתפרצות חזקה מצטמצמת על ידי חדירת אלקטרודה1. (טכניקות הקלטה של תיקון תאים שלמים, אשר ממזערות את הדליפה שהוצגה, חלות גם על נוירונים אחרים, אך אינן פועלות היטב על נוירונים עלוקה.) זה קריטי כי שיגור של נוירון HN גורם נזק מינימלי הנוירון (דליפה נוספת), והתנגדות קלט צריך להיות במעקב חייב להיות בטווח של 60-100 MOhms לניסויים מוצלחים4.
מהדק דינמי הוא טכניקה רבת עוצמה, אבל יש לו מגבלות שהוטלו על ידי גיאומטריה עצבית כי מוליכות מלאכותיות מיושמות באתר של אלקטרודה הקלטה – בדרך כלל גוף התא – לא באתר שבו זרמים יוצרי קצב הם בדרך כללמקומיים 5,6,10. בנוירונים HN עלוקה, גוף התא קרוב חשמלית לאזור האינטגרציה (נוריט עיקרי) של הנוירון שבו רוב הזרמים הפעילים הם מקומיים, קוצים מופעלים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכריסטיאן ארקסלבן על ניסויי מלחציים דינמיים ראשוניים על נוירונים HN(7) שהדגימו את יכולותיהם המתפוצצות. אנג’לה ונינג סייעה לניסויים בעצות מומחים. אנו מכירים NIH למימון עבודה זו באמצעות גרנט 1 R21 NS11355 ל- GSC ו- RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |