Qui viene presentato un metodo per lo studio dei ruoli della pompa Na+/ K+ e della corrente Na+ persistente negli interneuroni del cuore di sanguisuga utilizzando il morsetto dinamico.
La pompa Na+/K+, spesso pensata come una funzione di fondo nell’attività neuronale, contribuisce a una corrente verso l’esterno (pompaI) che risponde alla concentrazione interna di Na+ ([Na+]i). Nei neuroni bursting, come quelli che si trovano nelle reti neuronali del generatore di pattern centrale (CPG) che producono movimenti ritmici, ci si può aspettare che la [Na+]i e quindi la pompaI varino durante il ciclo di burst. Questa reattività all’attività elettrica, combinata con l’indipendenza dal potenziale di membrana, conferisce alla pompa proprietà dinamiche non comuni alle correnti basate su canali (ad esempio, canali di tensione o trasmettitori o di perdita). Inoltre, in molti neuroni, l’attività della pompa è modulata da una varietà di modulatori, espandendo ulteriormente il ruolo potenziale della pompa I nell’attività di scoppio ritmico. Questo documento mostra come utilizzare una combinazione di metodi di modellazione e di morsetto dinamico per determinare come pompare e la sua interazione con l’attività ritmica persistente di influenza Na+ corrente in un CPG. In particolare, questo documento si concentrerà su un protocollo di morsetto dinamico e metodi di modellazione computazionale negli interneuroni cardiaci di sanguisughe medicinali.
Il battito cardiaco nelle sanguisughe è guidato da un CPG costituito da 9 coppie bilaterali di interneuroni cardiaci (NN) distribuiti su altrettanti gangli segmentali del corpo centrale. Al centro del CPG ci sono coppie reciprocamente inibitorie di interneuroni situati nel 3° e 4° gangli segmentale che formano oscillatori semicentri (HCO) (Figura 1A). Questi neuroni continuano a scoppiare quando sinapticamente isolati farmacologicamente usando bicuculline1. Altri, come la coppia nel 7° gangli segmentale (il focus di questo protocollo), sono anche burster, in grado di produrre attività di scoppio quando isolati sinapticamente. Non sono reciprocamente collegati e ricevono solo input discendenti, e quindi sono facilmente isolati tagliando il ganglio dal resto del cordone nervoso. Questa attività di scoppio indipendente è sensibile alla corrente di dispersione introdotta causata dalla penetrazione con microelettrodi affilati per la registrazione, ma esplode vigorosamente quando registrata con metodi di patch sciolti1.
Sono stati modellati sia i singoli neuroni HN che gli HCO HN (modelli di compartimento isopotenziale singolo basati su Hodgkin-Huxley di neuroni HN contenenti tutte le correnti voltaggio-mo-ari e sinaptiche identificate sperimentalmente) e tutte le caratteristiche di scoppio del sistema vivente sono state catturate con successo2. La miomodulina, un neuropeptide endogeno nelle sanguisughe, diminuisce notevolmente il periodo (T) del ritmo di scoppio dei neuroni HN isolati e degli HCO HN. Questo modulatore agisce per aumentare la corrente h (corrente verso l’interno attivata dall’iperpolarizzazione, Ih) e per diminuire lapompaI3. Questa osservazione ha portato all’esplorazione di come lapompa I interagisce con Ihe di come la loro co-modulazione contribuisce all’attività ritmica dei neuroni HN. L’attivazione della pompa aumentando [Na+]i (usando lo ionoforo monensin) accelera il ritmo di scoppio HN sia negli HCO HN che nei neuroni HN isolati4. Questa velocità dipendeva da Ih. Quando Ih era bloccato (2 mM Cs+),il periodo di scoppio non è stato alterato da questo metodo di attivazione della pompa; tuttavia, la durata del burst (BD) è stata ridotta e l’intervallo di interburst (IBI) è aumentato sia negli HCO HN che nei neuroni HN isolati4.
Per questo protocollo, tutte le correnti di un neurone HN(7) vivente, inclusa la corrente della pompa, la pompaI,sono incorporate nel modello HN come segue:
(1)
dove C è la capacità di membrana (in nF), V è il potenziale di membrana (in V), t è il tempo (in s). Descrizioni ed equazioni dettagliate della corrente ionica sono state descritte altrove2,4. Il neurone modello HN completo funziona in tempo reale (Figura 2). Il software sarà reso disponibile su GitHub al momento della pubblicazione e sarà idoneo all’esecuzione sulla scheda di elaborazione del segnale digitale descritta nella Tabella dei Materiali. Qui, il focus dell’indagine è la corrente della pompa Na+/ K+ (pompaI) e le correnti voltaggio-4 che contribuiscono in modo significativo Na+ flusso: una corrente Na+ veloce (INa) e una corrente Na+ persistente (IP). Le conduttanze massime di queste correnti sono
rispettivamente. La pompa Na+/K+ scambia tre ioni Na+ intracellulari per due ioni K+ extracellulari, producendo così una corrente netta verso l’esterno. È importante sottolineare che pompa 3 volte più Na+ dal neurone di quanto indichi questa corrente, il che è importante per il calcolo della concentrazione intracellularedi Na +.
La corrente della pompa Na+/K+ dipende dalle concentrazioni intracellulari di Na+ ed è espressa dalla seguente funzione sigmoidale:
(2)
dove [Na]i è la concentrazione intracellulare di Na+, è la massima Na+/K+ corrente della pompa, [Na]ih è la concentrazione intracellulare di Na+ per la semi-attivazione della pompa Na+/K+ e [Na]è la sensibilità della pompa Na+/K+ a [Na]i. [Na]i si costruisce come risultato degli afflussi di Na+ trasportati da IP e INa ed è diminuito dall’efflusso Na+ della pompa Na+/ K+. Il contributo di Ih e ILeak al flusso totale di Na+ è piccolo e non è considerato nel modello in tempo reale.
(3)
dove, v è il volume (~6,7 pL) del serbatoio intracellulare Na+, F è la costante di Faraday e la concentrazione extracellulare di Na+ è mantenuta costante.
Le conduttanza voltaggio-uscita e di perdita sono state differenziate – queste rispondono al potenziale di membrana – dalla corrente della pompa, che è regolata dalla concentrazione intracellulare Na+ calcolata ([Na+]i). [Na+] i è costruito attraverso Na+ ingresso tramite la corrente na+ veloce (INa) che produce potenziali d’azione (picchi) e la corrente Na+ persistente (IP) che fornisce la depolarizzazione per supportare lo spiking. [Na+] i è, a sua volta, ridotto dall’azione della pompa attraverso l’estrusione di Na+. Sono stati assunti valori HN viventi di base di (5nS) e
(150 nS) e prendiamo in considerazione qualsiasi morsetto dinamico aggiunto
.
L’obiettivo del protocollo qui descritto è quello di manipolare lapompa I in modo preciso e reversibile in tempo reale per scoprire come interagisce con le correnti voltaggio-mozionato (corrente Na+ persistente nel protocollo di corrente) per controllare lo scoppio ritmico in singoli NN. Per raggiungere questo obiettivo, è stato utilizzato un morsetto dinamico, che introduce artificialmente, su comando, una quantità precisa di qualsiasi corrente che può essere calcolata mentre il modello è in esecuzione. Questo metodo ha vantaggi rispetto alla manipolazione farmacologica della pompa, che colpisce l’intero tessuto, può avere effetti fuori bersaglio che sono spesso difficili da invertire e non possono essere manipolati con precisione. Il morsetto dinamico5,6 legge la tensione di un neurone registrato in tempo reale(Figura 1B)e calcola e inietta, in tempo reale, la quantità di qualsiasi corrente in base alle equazioni del modello e ai valori impostati di qualsiasi o
. Metodi simili possono essere facilmente applicati a qualsiasi neurone che può essere registrato intracellulare. Tuttavia, i parametri dovranno essere riscalati al neurone scelto e il neurone dovrà essere isolato dagli input sinaptici, ad esempio farmacologicamente.
La modellazione, il morsetto dinamico e le analisi risultanti che abilitano sono tecniche utili per esplorare come individui e gruppi di conduttanza / correnti ioniche contribuiscono all’attività elettrica dei neuroni (Figura 1, Figura 2,Figura 4e Figura 5). L’uso di queste tecniche mostra come la corrente della pompa Na+/ K+ (pompaI) interagisce con le correnti voltaggio-4, in particolare la corrente Na+ persistente (IP), per promuovere un robusto scoppio nel nucleo del generatore di battito cardiaco della sanguisuga. Combinando esperimenti di morsetto dinamico e modellazione, è possibile testare i modelli in modo più diretto di quanto sia possibile con le normali tecniche di registrazione della tensione e di morsetto di corrente. I risultati raccolti dagli esperimenti di morsetto dinamico (Figura 5) saranno utilizzati per perfezionare ulteriormente il modello HN. Il metodo di base del serraggio dinamico qui dimostrato può essere personalizzato per riflettere le proprietà di qualsiasi neurone in studio se un modello matematico di correnti neuronali può essere determinato con esperimenti di morsetto di tensione.
Il completamento con successo degli esperimenti del tipo mostrato qui richiede un’attenta impalatura di un HN o di un altro neurone quando si utilizza un microelettrodo affilato, perché il forte scoppio è limitato dalla penetrazione dell’elettrodo1. (Le tecniche di registrazione dei cerotti a cellule intere, che riducono al minimo le perdite introdotte, sono applicabili anche ad altri neuroni, ma non funzionano bene sui neuroni delle sanguisuga.) È fondamentale che l’impalamento del neurone HN causi danni minimi al neurone (perdita aggiunta) e la resistenza all’input deve essere monitorata e deve essere nell’intervallo di 60-100 MOhms per esperimenti di successo4.
Il morsetto dinamico è una tecnica potente, ma ha limitazioni imposte dalla geometria neuronale perché le conduttanze artificiali sono implementate nel sito dell’elettrodo di registrazione – di solito il corpo cellulare – non nel sito in cui le correnti generatrici di ritmo sono solitamente localizzate5,6,10. Nei neuroni HN della sanguisuga, il corpo cellulare è elettricamente vicino alla zona di integrazione (neurite principale) del neurone in cui sono localizzate le correnti più attive e vengono avviati i picchi.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Christian Erxleben per gli esperimenti preliminari di morsetto dinamico sui neuroni HN(7) che hanno dimostrato le loro capacità di scoppio. Angela Wenning ha aiutato gli esperimenti con la consulenza di esperti. Riconosciamo il NIH per aver finanziato questo lavoro attraverso grant 1 R21 NS111355 a GSC e RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |