Здесь представлен метод исследования ролей насоса Na+/ K+ и постоянного тока Na+ в интернейронах сердца пиявки с использованием динамического зажима.
Насос Na+/ K+, часто считающийся фоновой функцией в нейронной активности, вносит внешний ток(Iнасос),который реагирует на внутреннюю концентрацию Na+ ([Na+]i). В разрывающихся нейронах, таких как те, которые находятся в нейронных сетях центрального генератора паттернов (CPG), которые производят ритмические движения, можно ожидать, что [Na+]i и, следовательно,насосI , будут изменяться на протяжении всего цикла всплеска. Эта реакция на электрическую активность в сочетании с независимостью от мембранного потенциала наделяет I насос динамическими свойствами, не общими для токов на основе каналов (например, каналов с напряжением или передатчиком или протекающих каналов). Более того, во многих нейронах активность насоса модулируется различными модуляторами, что еще больше расширяет потенциальную роль I-насоса в ритмической разрывной активности. В данной работе показано, как использовать комбинацию методов моделирования и динамического зажима для определения того, как янакачиваю и его взаимодействие с постоянным Na+ током влияния ритмической активности в ЦПГ. В частности, в этой статье основное внимание будет уделено протоколу динамического зажима и методам вычислительного моделирования в интернейронах сердца лекарственных пиявок.
Сердцебиение у пиявок управляется CPG, состоящим из 9 двусторонних пар сердечных интернейронов (HNs), распределенных по столько же сегментарных ганглиев среднего тела. В ядре ЦПГ находятся взаимно тормозные пары интернейронов, расположенных в3-м и 4-м сегментаральныхганглиях, образующих полуцентровые осцилляторы (ГКО)(рисунок 1А). Эти нейроны продолжают лопаться при синаптически изолировании фармакологически с использованием бикукулина1. Другие, такие как пара в7-х сегментных ганглиях (фокус этого протокола), также являются разрывными, способными производить разрывную активность при синаптически изолированном. Они не связаны друг сном и получают только нисходящий вход, и поэтому легко изолируются путем разрыва ганглия от остальной части нервного кана. Эта независимая разрывная активность чувствительна к введению тока утечки, вызванного проникновением с острыми микроэлектродами для записи, но энергично лопается при регистрации методами рыхлого пластыря1.
Были смоделированы как отдельные нейроны HN, так и HN HCP (модели одного изопотенциального компартмента нейронов HN на основе Ходжкина-Хаксли, содержащие все экспериментально идентифицированные напряжения и синаптические токи), и все характеристики всплеска живой системы были успешно захвачены2. Миомодулин, эндогенный нейропептид у пиявок, заметно уменьшает период (Т) ритма разрыва изолированных нейронов HN и HN HPO. Этот модулятор действует для увеличения h-тока (гиперполяризационный активируемый внутренний ток, Iч)и для уменьшения Iнасоса3. Это наблюдение привело к исследованию того, как Ipump взаимодействует с Ih,и как их комодуляция способствует ритмической активности нейронов HN. Активация насоса путем увеличения [Na+]i (с использованием моненсина ионофора) ускоряет ритм всплеска HN как в HN HCP, так и в изолированных нейронах HN4. Это ускорение зависело от Iч. Когда Iч блокировался (2 мМCs+),период разрыва не изменялся этим методом активации насоса; однако продолжительность всплеска (BD) была сокращена, а интервал между вспышками (IBI) увеличился как в HN HCP, так и в изолированных нейронах HN4.
Для этого протокола все токи живого нейрона HN(7), включая ток насоса, Iнасос,включаются в модель HN следующим образом:
(1)
где C — емкость мембраны (в nF), V — мембранный потенциал (в V), t — время (в s). Подробные описания и уравнения ионных токов были описаны в других местах2,4. Полная модель нейрона модели HN работает в режиме реальноговремени (рисунок 2). Программное обеспечение будет доступно на GitHub после публикации и будет подходить для работы на плате цифровой обработки сигналов,описанной в Таблице материалов. Здесь в центре внимания находится ток насоса Na+/ K+ (насосI)и токи с напряжением, способствующие значительному потоку Na+: быстрый ток Na+ (INa)и постоянный Ток Na+ (IP). Максимальные проводимости этих токов
соответственно. Насос Na+/ K+ обменивает три внутриклеточных иона Na+ на два внеклеточных K+ иона, тем самым производя чистый внешний ток. Важно отметить, что он выкачивает в 3 раза больше Na+ из нейрона, чем указывает этот ток, что важно для расчета внутриклеточной концентрации Na+.
Ток насоса Na+/K+зависит от внутриклеточных концентрацийNa+ и выражается следующей сигмоидальной функцией:
(2)
где [Na]i — внутриклеточная концентрация Na+, — максимальный ток насоса Na+/K+, [Na]ih — внутриклеточная концентрация Na+ для полуактивации насоса Na+/K+, а [Na]— чувствительность насоса Na+/K+ к [Na]i. [Na]i строится в результате притоков Na+, переносимых IP и INa, и уменьшается Na+ оттоком Na+/ K+ насоса. Вклад Ih и ILeak в общий потокNa+ невелик и не учитывается в модели реального времени.
(3)
где, v — объем (~6,7 пЛ) внутриклеточногоNa+ резервуара, F — постоянная Фарадея, а внеклеточная концентрация Na+ поддерживается постоянной.
Дифференцированы проводимость с напряжением и утечкой – они реагируют на мембранный потенциал – от тока насоса, который регулируется расчетной внутриклеточной концентрацией Na+ ([Na+]i). [На+] i строится через вход Na+ через быстрый ток Na+ (INa),который производит потенциалы действия (пики) и постоянный Ток Na+ (IP),который обеспечивает деполяризацию для поддержки всплеска. [На+] i, в свою очередь, уменьшается под действием насоса через экструзиюNa+. Были приняты исходные значения HN (5nS) и
(150 nS), и мы учитываем любой добавленный динамический
зажим.
Цель протокола, описанного здесь, состоит в том, чтобы манипулировать I насосом точно и обратимо в режиме реального времени, чтобы обнаружить, как он взаимодействует с токами с напряжением (постоянный ток Na+ в текущем протоколе) для управления ритмическим разрывом в одиночных ХН. Для достижения этой цели был использован динамический зажим, который искусственно вводит по команде точное количество любого тока, который может быть рассчитан по мере работы модели. Этот метод имеет преимущества перед фармакологическими манипуляциями с насосом, который влияет на всю ткань, может иметь нецелевые эффекты, которые часто трудно обратить вспять, и которыми нельзя точно манипулировать. Динамический зажим5,6 считывает напряжение записанного нейрона в режиме реальноговремени (рисунок 1B)и вычисляет и вводит в режиме реальноговремени величину любого тока на основе модельных уравнений и заданных значений любого или
. Подобные методы могут быть легко применены к любому нейрону, который может быть записан внутриклеточным способом. Однако параметры должны быть перемасштабированы до выбранного нейрона, и нейрон должен быть изолирован от синаптических входов, например, фармакологически.
Моделирование, динамический зажим и результирующий анализ, который они позволяют, являются полезными методами для изучения того, как отдельные и группы ионной проводимости / токов способствуют электрической активности нейронов(рисунок 1, рисунок 2,рисунок 4и рисунок 5). Использование этих методов показывает, как ток насоса Na+/ K+ (насосI)взаимодействует с токами с напряжением, особенно постоянным током Na+ (IP),чтобы способствовать надежному разрыву в сердечнике генератора сердцебиения пиявки. Комбинируя эксперименты с динамическими зажимами и моделирование, можно тестировать модели более непосредственно, чем это возможно с помощью обычных методов регистрации напряжения и тока. Результаты, полученные в ходе экспериментов с динамическим зажимом(рисунок 5), будутиспользованы для дальнейшего уточнения модели HN. Основной метод динамического зажима, продемонстрированный здесь, может быть настроен для отражения свойств любого изучаемого нейрона, если математическая модель нейронных токов может быть определена с помощью экспериментов с зажимом напряжения.
Успешное завершение экспериментов показанного здесь типа требует тщательного прокалывания HN или другого нейрона при использовании острого микроэлектрода, поскольку сильное расщепление ограничивается проникновением электрода1. (Методы записи цельноклеточных патчей, которые минимизируют вводимую утечку, также применимы к другим нейронам, но не очень хорошо работают на нейронах пиявки.) Крайне важно, чтобы прокалывание нейрона HN нанесло минимальный ущерб нейрону (добавленная утечка), а входное сопротивление должно контролироваться и должно быть в диапазоне 60-100 МОм для успешных экспериментов4.
Динамический зажим является мощным методом, но он имеет ограничения, налагаемые геометриейнейронов,потому что искусственные проводимости реализуются в месте регистрирующего электрода – обычно тела клетки – а не в месте, где ритм-генерирующие токи обычно локализованы5,6,10. В нейронах HN пиявки тело клетки электрически близко к зоне интеграции (главному нейриту) нейрона, где локализуется наиболее активные токи и инициируются шипы.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Кристиана Эркслебена за предварительные динамические эксперименты с зажимом на нейронах HN(7), которые продемонстрировали их разрывные способности. Анджела Веннинг помогала экспериментам советами экспертов. Мы благодарим NIH за финансирование этой работы через грант 1 R21 NS111355 GSC и RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |