Presenteras här är en metod för undersökning av rollerna för Na+/ K+ pump och ihållande Na+ ström i leech hjärta interneurons med hjälp av dynamisk klämma.
Na+/ K+ pumpen, ofta tänkt som en bakgrundsfunktion i neuronal aktivitet, bidrar med en utåtström (jagpump) som svarar på den inre koncentrationen av Na+ ([Na+]i). I spruckna nervceller, som de som finns i centrala mönstergenerator (CPG) neuronala nätverk som producerar rytmiska rörelser, kan [Na+]i och därförI-pumpen, förväntas variera under hela sprängcykeln. Denna responsivitet för elektrisk aktivitet, i kombination med oberoende från membranpotential, ger jag pump med dynamiska egenskaper som inte är gemensamma för kanalbaserade strömmar (t.ex. spännings- eller sändar-gated eller läckagekanaler). Dessutom, i många nervceller, pumpens aktivitet moduleras av en mängd olika modulatorer, ytterligare utöka den potentiella rollen av jagpump i rytmisk sprängning verksamhet. Detta dokument visar hur man använder en kombination av modellering och dynamiska klämmetoder för att bestämma hur jagpumpar och dess interaktion med ihållande Na+ ström påverkar rytmisk aktivitet i en CPG. Specifikt kommer detta dokument att fokusera på ett dynamiskt klämprotokoll och beräkningsmodelleringsmetoder i hjärtpraktorer av medicinska leeches.
Hjärtslag i leeches drivs av en CPG bestående av 9 bilaterala par hjärt interneurons (HNs) fördelade över så många mellankropps segmentala ganglier. Kärnan i CPG är ömsesidigt hämmande par interneuroner belägna i 3rd och 4:e segmentella ganglier som bildar halvcenter oscillatorer (HCOs) (Figur 1A). Dessa nervceller fortsätter att brista när synaptiskt isolerade farmakologiskt med bicuculline1. Andra, som paret i den7: e segmentella ganglierna (fokus för detta protokoll), är också bursters, som kan producera bursting aktivitet när synaptiskt isolerade. De är inte ömsesidigt anslutna och får endast fallande ingång, och isoleras därför lätt genom att bryta ganglionen från resten av nervsladden. Denna oberoende sprängningsaktivitet är känslig för införd läckageström orsakad av penetration med skarpa mikroelektroder för inspelning men spricker kraftigt när den registreras med lösa patchmetoder1.
Både enskilda HN-nervceller och HN HCOs har modellerats (Hodgkin-Huxley-baserade enispotentialfackmodeller av HN-nervceller som innehåller alla experimentellt identifierade spännings-gated och synaptiska strömmar), och alla burst egenskaper i det levande systemet har framgångsrikt fångats2. Myomodulin, en endogen neuropeptid i leeches, minskar markant perioden (T) av burst rytmen av isolerade HN nervceller och HN HCOs. Denna modulator verkar för att öka h-strömmen (hyperpolariseringsaktiverad inåtström, Ih) och för att minskapumpen3. Denna observation ledde till utforskningen av hurjag pumpar interagerar med Ih, och hur deras sammodulering bidrar till den rytmiska aktiviteten hos HN-neuroner. Aktivering av pumpen genom att öka [Na+]i (med hjälp av jonofore monensin) påskyndar HN burst rytmen i både HN HCOs och isolerade HN nervceller4. Denna hastighet var beroende av Ih. När Ih blockerades (2 mM Cs+) ändrades inte burst-perioden med denna metod för pumpaktivering; Burst varaktigheten (BD) begränsades dock, och det interburst intervallet (IBI) ökade i både HN HCOs och isolerade HN nervceller4.
För detta protokoll införlivas alla strömmar av en levande HN(7) neuron, inklusive pumpströmmen, Ipump, i HN-modellen enligt följande:
(1)
där C är membrankeacitansen (i nF), är V membranpotentialen (i V), t är tid (i s). Detaljerade joniska aktuella beskrivningar och ekvationer har beskrivits någon annanstans2,4. Den kompletta HN-modellen neuron körs i realtid (Figur 2). Programvaran kommer att göras tillgänglig på GitHub vid publicering och kommer att vara lämplig att köra på den digitala signalbehandlingstavlan som beskrivs i materialförteckningen. Här är fokus för förfrågan Na+/ K+ pumpströmmen ( jag pump )ochde spänningsportade strömmarna som bidrar med betydande Na+ flöde: en snabb Na+ ström (INa) och en ihållande Na+ ström (IP). De maximala ledningarna för dessa strömmar
är respektive. Na+/ K+ pumpen byter tre intracellulära Na+ joner mot två extracellulära K+ joner, vilket ger en netto utåtström. Viktigt är att den pumpar 3 gånger så mycket Na+ ur neuron som denna ström indikerar, vilket är viktigt för att beräkna den intracellulära Na+ koncentrationen.
Pumpströmmen Na+/K + beror på intracellulära Na+ koncentrationer och uttrycks med följande sigmoidala funktion:
(2)
där [Na]i är den intracellulära Na+ koncentrationen, är den maximala Na+/ K+ pumpströmmen, [Na]ih är den intracellulära Na+ koncentrationen för halvaktivering av Na+/ K+ pumpen, och [Na]är känsligheten hos Na+/ K+ pumpen till[Na] i. [Na]jag bygger som ett resultat av Na+ tillströmningar som bärs av IP och INa och minskas av Na+ efflux av Na+/ K+ pumpen. Bidraget från Ih och ILeak till det totala Na+ flödet är litet och beaktas inte i realtidsmodellen.
(3)
där v är volymen (~6,7 pL) av den intracellulära Na+ behållaren, F är Faradays konstant och den extracellulära Na+ koncentrationen hålls konstant.
Spännings-gated och läckageledning har differentierats-dessa svarar till membranpotential – från pumpaströmmen, som regleras av den beräknade intracellulära Na+ koncentrationen ([Na+]i). [Na+] Jag är uppbyggd via Na+ post via den snabba Na+ ström (INa) som producerar åtgärdspotentialer (spikar) och den beständiga Na+ ström (IP) som ger depolarisering för att stödja spikning. [Na+] Jag reduceras i sin tur av pumpens verkan genom extruderingen av Na+. Baslinje levande HN-värden på (5nS)
och (150 nS) har antagits, och vi tar hänsyn till eventuella extra dynamiska klämmor
.
Målet med protokollet som beskrivs här är att manipulera jagpumpar exakt och reversibelt i realtid för att upptäcka hur det interagerar med spännings-gated strömmar (ihållande Na+ ström i det nuvarande protokollet) för att styra rytmisk sprängning i enstaka HNs. För att uppnå detta mål användes dynamisk klämma, som artificiellt introducerar, efter kommando, en exakt mängd av alla strömmar som kan beräknas när modellen körs. Denna metod har fördelar jämfört med farmakologisk manipulering av pumpen, som påverkar hela vävnaden, kan ha off-target effekter som ofta är svåra att vända, och kan inte manipuleras exakt. Dynamiskklämma 5,6 läser spänningen hos en inspelad neuron i realtid ( Figur1B) och beräknar och injicerar i realtid mängden ström baserat på modellekvationer och de inställda värdena för någon eller
. Liknande metoder kan enkelt tillämpas på alla neuroner som kan registreras intracellulärt. Parametrar måste dock omskalas till den valda neuron, och neuron bör isoleras från synaptiska ingångar, t.ex. farmakologiskt.
Modellering, dynamisk klämma och de resulterande analyser som de möjliggör är användbara tekniker för att utforska hur individer och grupper av jonisk ledning/strömmar bidrar till neuroners elektriska aktivitet(figur 1, figur 2,figur 4och figur 5). Användningen av dessa tekniker visar hur Na+/ K+ pumpströmmen ( jag pump )interagerarmed spänningsgrindade strömmar, särskilt den ihållande Na+ strömmen (IP), för att främja robust sprängning i leech heartbeat mönster generatorns kärna HNs. Genom att kombinera dynamiska klämexperiment och modellering är det möjligt att testa modeller mer direkt än vad som är möjligt med vanlig spänningsregistrering och strömklämmatekniker. Resultaten från de dynamiska klämexperimenten (figur 5) kommer att användas för att ytterligare förfina HN-modellen. Den grundläggande metoden för dynamisk fastspänning som demonstreras här kan anpassas för att återspegla egenskaperna hos alla neuroner som studeras om en matematisk modell av neuronala strömmar kan bestämmas med spänningsklämmorexperiment.
Framgångsrikt slutförande av experiment av den typ som visas här kräver noggrann impalement av en HN eller annan neuron när man använder en skarp mikroelektrod, eftersom stark sprängning begränsas av elektrodpenetration1. (Helcelliga patchinspelningstekniker, som minimerar införd läcka, är också tillämpliga på andra nervceller, men fungerar inte bra på leechneuroner.) Det är viktigt att impalementen av HN-neuron orsakar minimal skada på neuron (extra läcka), och ingångsmotstånd bör övervakas och måste vara i intervallet 60-100 MOhms för framgångsrika experiment4.
Dynamisk klämma är en kraftfull teknik, men den har begränsningar som införts av neuronal geometri eftersom de konstgjorda ledningarna implementeras på platsen för inspelningselektroden – vanligtvis cellkroppen – inte på den plats där rytmgenererande strömmar vanligtvis ärlokaliserade 5,6,10. I leech HN-nervceller är cellkroppen elektriskt nära integrationszonen (huvud neuriten) i neuron där de flesta aktiva strömmar är lokaliserade och spikar initieras.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Christian Erxleben för preliminära dynamiska klämexperiment på HN(7) nervceller som visade sin bristningskapacitet. Angela Wenning hjälpte experimenten med expertråd. Vi bekräftar NIH för att finansiera detta arbete genom Grant 1 R21 NS111355 till GSC och RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |