כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלה אנושית, ההדבקה וההדבקה על אפיתליה פני הרחם והפלישה הבאה של blastocyst לתוך ההחלטה אימהית, הוא אירוע ביולוגי קריטי אך אניגמטי כי היה קשה מבחינה היסטורית ללמוד בשל מגבלות טכניות ואתיות. ההשתלה היא יזם על ידי הפיתוח של trophectoderm כדי trophoblast מוקדם ובדידול הבאים לתוך קווי משנה trophoblast ברורים. בידול trophoblast מוקדם חריג עלול להוביל לכשל השתלה, פתולוגיות שליה, חריגות עובר, הפלה. לאחרונה, פותחו שיטות המאפשרות לעוברים אנושיים לגדול עד היום ה-13 לאחר הפריה במבחנה בהיעדר רקמות אימהיות, פרק זמן המקיף את תקופת ההשתלה בבני אדם. זה נתן לחוקרים את ההזדמנות לחקור השתלה אנושית ולסיכום הדינמיקה של בידול trophoblast בתקופה קריטית זו מבלי לבלבל השפעות אימהיות והימנעות מכשולים טבועים ללמוד אירועי בידול העובר מוקדם ב vivo. כדי לאפיין תת-קוובלסטים שונים במהלך ההשתלה, אימצנו שיטות תרבות דו-ממדיות (דו-ממדיות) קיימות ופיתחו הליך לעיכול אנזימטי ולבודד סוגים שונים של תאי טרופוביסט לתאגידות במורד הזרם. עוברים תרבותיים בתנאים דו-ממדיים יש מורפולוגיה שטוחה יחסית עשוי להיות תת אופטימלי במידול בארכיטקטורות עובריות vivo תלת מימדי (3D). עם זאת, בידול trophoblast נראה פחות מושפע כפי שהוכח על ידי מורפולוגיה צפויה ושינויים ביטוי גנים במהלך תרבות מורחבת. קווי משנה שונים של trophoblast, כולל ציטוטרוהובלסט, סינכרון ו-trophoblast נודדים יכולים להיות מופרדים לפי גודל, מיקום והופעה זמנית, ולהשתמש בהם לאפיון נוסף או ניסויים. חקירה של תאים אלה trophoblast מוקדם עשוי להיות חיוני בהבנת השתלה אנושית, טיפול פתולוגיות שליה נפוצות, ולהקל על השכיחות של אובדן הריון.
מבוא
השתלה אנושית והוווים של שליה מוקדמת קשה מבחינה היסטורית לחקור ולהישאר ידוע במידה רבה כי רקמות אנושיות אינן נגישות בשלב זה כאשר ההריון הוא בלתי ניתן לגילוי קלינית. מודלים של בעלי חיים אינם מספקים, מכיוון של שליה אנושית יש מאפיינים ייחודיים משלה בהשוואה ליונקים אחרים. לדוגמה, שליה אנושית פולשת עמוק לתוך ההחלטה עם כמה תאים trophoblast להגיע לפחות את השלישי הפנימי של רירית הרחם בעוד תאים אחרים לאשט את העורקים ספירליים הרחם. אפילו אבותינו האבולוציוניים הקרובים ביותר, הפרימטים הלא אנושיים, מראים הבדלים במורפולוגיה שליה ובאינטראקציות טרופיות עם הרקמות המחליטותהאימהיות 1,,2,,3. קבלת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העוברים האנושיים נתרמו בהסכמה לשימוש במחקר. פרוטוקולים לתרבות עובר אנושית מורחבת אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית המערבית (מחקר מס' 1179872) ובהתאם להנחיות הבינלאומיות. כל שימוש בעוברים אנושיים חייב להיבחן על ידי האתיקה המתאימה וגופים שלטוניים הקשורים למוסד המחקר באמצעות פרוטוקול זה.
1. הכנה
- הכן את אמצעי התקשורת והצלחות ההתאוששות יום אחד לפני התחממות העובר במכסה מנוע זרימה למינאר סטרילי.
- הכן 2 מ"ל של תקשורת תרבות blastocyst (BM) עם 10% v / v תחליף חלבון סרום (SPS).
הערה: תקשורת תרבות Blastocyst עשויה להכיל או לא יכולה להכיל חלבון נוסף. כאן, השתמשנו במדיום שיש להשלים עם 10% של חלבון אלבומין שצוין. בדוק את ההנחיות של ....
- הכן 2 מ"ל של תקשורת תרבות blastocyst (BM) עם 10% v / v תחליף חלבון סרום (SPS).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עוברים בריאים הפגינו המשך התפשטות במהלך תרבות מורחבת (איור 2B). עוברים חריגים החלו לסגת מהקצוות החיצוניים שלהם והתפוררו(איור 2C). מניסיוני, כ-75% מהעוברים היו מחוברים לתחתית המנה המצופה בפיברונקטין ב-48 שעות והחיבור גדל לכ-90% ב-72 שעות בתרבות. ההצלחה של חיבור העובר עשויה להיות מושפעת במידה רבה על ידי האיכות הראשונית של blastocysts. עוברים שלא מחוברים עד 72 שעות כנראה לא ישרדו.
ב D8 לאחר הפריה (D3 של תרבות מורחבת), רוב התאים בעוברים ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התפתחות הפרוטוקול לתרבות עוברים אנושיים באמצעות השתלה אפשרה למדענים לחקור תקופה לא ממופה בעבר בפיתוח8,9. כאן, אנו משתמשים במערכת תרבות מורחבת כדי לתרבות עוברים אנושיים וללמוד בידול trophoblast מוקדם לפני היווצרות שליה villous. השיטות המתוארות כאן מאפשרות לנו לאסוף קווי משנה שונים של TB לשימוש בניתוח תא יחיד במורד הזרם. עבודה זו מאפשרת לקהילה המדעית הזדמנות להבין תקופה קריטית ואדיגמטית זו בהתפתחות האנושית, עשויה לפתוח הזדמנויות חדשות לטיפולים טיפוליים להפלה או פתו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להכיר בחולים הרבים במרכז קולורדו לרפואת פוריות (CCRM) שתרמו באדיבות את העוברים שלהם למחקר. ברצוננו גם להודות קארן Maruniak ואת המעבדה הקלינית ב CCRM על עזרתם בעיבוד דגימות hCG, כמו גם סו מקורמיק וצוות אמבריולוגיה הפריה חוץ גופית קלינית שלה ב CCRM על עזרתם עם איסוף עובר, אחסון, מעקב, ותרומה. המימון סופק באופן פנימי על ידי CCRM.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק סטרילי NORM JECT Luer Lock | VWR | 53548-019 | חבילה של 100 |
| 3130 או 3110 Forma Series II חממת CO2 עם מעטפת מים | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 מ"מ צלחת תרבית רקמות קורנינג פרימריה | VWR | 62406-038 | מארז של 500 |
| 5 מ"ל צינור כובע הצמד | VWR | 60819-295 | חבילה של 25 |
| רקמות קורנינג פרימריה 60 מ"מ צלחת תרבות | VWR | 25382-687 | מארז של 200 |
| צלחת 6 בארות | Agtech Inc. | D18 | חבילה של 1, 10 או 50 |
| תמיסה של טירוד חומצי | Millipore Sigma | T1788 | 100 מ"ל |
| ביוטיקס 1250 ומיקרו; קצות פיפטה | L VWR | 76322-156 | חבילה של 960 |
| פיצוץ, מדיה לתרבית בלסטוציסט | Origio | 83060010 | 10 מ"ל |
| תמיסת דילול | Kitazato | VT802 | 1 x 4 מ"ל |
| חד פעמי בורוסיליקט זכוכית פסטר פיפט | תרמו פישר מדעי | 1367820D | 5.75 אינץ'. (146 מ"מ); 720/CS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Salt | Millipore Sigma | D8537 | |
| שמן פרפין תרבית עובר OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 מ"ל |
| צינורות Eppendorf PCR 0.2 מ"ל | VWR | 47730-598 | חבילה של 1,000 |
| צינורות Eppendorf PCR 0.5 מ"ל | VWR | 89130-980 | מארז של 500 |
| פיברונקטין מפלזמה אנושית. תמיסה נוזלית .1% | Millipore Sigma | F0895 | 1 מ"ג |
| גילסון 1 מ"ל Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 & מיקרו; ל |
| גילסון 20 ומיקרו; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 ומיקרו; ל |
| גילסון 200 ומיקרו; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 ומיקרו; L |
| G-MOPS טיפול במדיה | Vitrolife | 10129 | 125 מ"ל |
| טיפול במדיה | Origio | 83100060 | 60 מ"ל |
| Ibidi 8 כיסוי תא היטב | Ibidi | 80826 | 15 שקופיות לכל קופסה |
| IVC1 / IVC2 | מערכות הנחיית תאים | M11-25 / M12-25 | 5-5 מ"ל aliquots |
| K מערכת T47 צלחת חימום | קופר כירורגית | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex מסנני מזרק סטריליים עם Durapore PVFD ממברנה | פישר SLGVR33RS מדעי | חבילה של 50 | |
| חתיכות | פה IVF חנות | MP-001-Y | 100 חתיכות |
| צלחת באר מרכז Oosafe | OOPW-CW05-1 | מארז של 500 | |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 מ"ל |
| צינורות לטקס גומי לחלקי פה | חנות | IVFS IVFS-NRL-B-5 | 5 רגל |
| סטריאומיקרוסקופ | ניקון | SMZ1270 | |
| טיפים חשפנית | קופר כירורגי | MXL3-275 | 20/pk 275 ומיקרו; m |
| פתרון הפשרה | Kitazato | VT802 | 2 x 4 מ"ל |
| החשפנית Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), ללא פנול אדום | תרמו פישר מדעי | 12604013 | 1 x 100 מ"ל |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | בקבוק 25 מ"ל |
| VWR 1-20 ומיקרו; קצות פיפטה L | VWR | 76322-134 | חבילה של 960 |
| VWR 1-200 ומיקרו; קצות פיפטה L | VWR | 89174-526 | חבילה של 960 |
| תמיסת כביסה | Kitazato | VT802 | 1 x 4 מ"ל |
מקורות
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnen....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
