RNA-interferens er en bredt anvendelig, kraftfuld teknik til at manipulere genekspression på bestemte udviklingsstadier. Her beskriver vi de nødvendige skridt til at gennemføre denne teknik i den akvatiske dykning bille Thermonectus marmoratus, fra erhvervelse af gensekvenser til knockdown af gener, der påvirker struktur eller adfærd.
RNA interferens (RNAi) er fortsat en kraftfuld teknik, der giver mulighed for målrettet reduktion af genekspression gennem mRNA nedbrydning. Denne teknik gælder for en bred vifte af organismer og er meget effektiv i den artsrige orden Coleoptera (biller). Her opsummerer vi de nødvendige skridt til at udvikle denne teknik i en ny organisme og illustrerer dens anvendelse på de forskellige udviklingsstadier i den akvatiske dykkerbille Thermonectus marmoratus. Målgensekvenser kan opnås omkostningseffektivt gennem samling af transkriptik mod en nær slægtning med kendt genomik eller de novo. Kandidat gen kloning udnytter en specifik kloning vektor (pCR4-TOPO plasmid), som giver mulighed for syntesen af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) for ethvert gen med brug af en enkelt fælles primer. Det syntetiserede dsRNA kan sprøjtes ind i enten embryoner til tidlige udviklingsprocesser eller larver til senere udviklingsprocesser. Vi illustrerer derefter, hvordan RNAi kan injiceres i akvatiske larver ved hjælp af immobilisering i agarose. For at demonstrere teknikken giver vi flere eksempler på RNAi-eksperimenter, der genererer specifikke knockdowns med forudsagte fænotyper. Specifikt, RNAi for garvning gen laccase2 fører til neglebånd afhjævning i både larver og voksne, og RNAi for øjet pigmentering gen hvid producerer en afhænding / manglende pigmentering i øjet rør. Desuden fører knockdown af en vigtig linse protein til larver med optiske mangler og en reduceret evne til at jage bytte. Kombineret, disse resultater eksemplificere magt RNAi som et redskab til at undersøge både morfologiske mønstre og adfærdsmæssige træk i organismer med kun transskriptionomic databaser.
Spørgsmålet om, hvordan specifikke gener bidrager til udviklingen af forskellige træk er et spændende emne i biologi. I løbet af de sidste par årtier er der gjort store fremskridt med hensyn til dissekering af de genetiske fundamenter for udviklingsprocesser i nogle få model organismer, såsom nematode Caenorhabditis elegans, frugtfluen Drosophila melanogaster, og huset mus mus musculus1. For nylig har opfindelsen af kraftfulde genredigeringsteknikker såsom grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/Cas92 givet mulighed for at ændre den genetiske kode af ikke-model organismer (for eksempelse 3,4). Som følge heraf har der været en stigning i genetiske undersøgelser af en række forskellige organismer, der ikke tidligere var blevet kontaktet gennem molekylære teknikker. I betragtning af den enorme mangfoldighed af vores dyreriget, med mange interessante træk eller træk varians, der kun er repræsenteret i bestemte arter, har dette fremskridt gjort det til en spændende tid for evolutionær-udviklingsmæssige biologi (“evo-devo”) relateret arbejde. Genomredigeringsteknikker, der er tilgængelige for ikke-modelorganismer, er imidlertid relativt begrænsede med hensyn til de udviklingsmæssige tidspunkter, som de kan anvendes på, hvilket gør det udfordrende at skelne de tidsmæssige egenskaber relateret til den rolle, som specifikke gener spiller i ethvert træk. Desuden er transgene teknikker ofte begrænset til gener, der ikke er væsentlige for overlevelse (dvs. hvis knockout ikke resulterer i dødelighed). Selv om genredigeringsteknikker er begyndt at blive populære, er der derfor stadig behov for effektive teknikker, der gælder for en række forskellige organismer på bestemte udviklingstidspunkter og letter delvise knockdowns (snarere end fuldstændig tab af funktion). Her henleder vi opmærksomheden på RNA-interferens (RNAi), en noget dateret, men kraftfuld gen knockdown teknik5, der er særligt værdifuld som en synergistisk tilgang til genredigering. Konkret udviklede vi procedurer, der giver mulighed for anvendelse af RNAi på vanddykning biller som et eksempel, der illustrerer gennemførelsen af denne teknik, fra erhvervelse af de nødvendige molekylære sekvenser til en vellykket injektion af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) i æg og larver.
RNAi-baserede gen knockdown udnytter en medfødt forsvarsmekanisme af organismer, hvor dsRNA molekyler lette hæmning af invaderende nukleinsyre sekvenser, såsom vira og transposons6. Kort sagt tages dsRNA op i cellen, hvor det skæres i 20-25 nukleotidstykker af Dicer-enzymet. Disse stykker aktiverer derefter dannelsen af det RNA-inducerede lyddæmningskompleks (RISC), som hæmmer det målrettede mRNA ved at binde sig til det på bestemte steder ved hjælp af styrestrengen. Denne proces fører i sidste ende til mRNA-nedbrydning og forstyrrer dermed oversættelsen af mRNA til det respektive protein6. Den RNAi-baserede gen knockdown teknik præsenteret her derfor er afhængig af injektion af dsRNA. For dyremodeller blev denne teknik oprindeligt udviklet i C. elegans7 og D. melanogaster8, men har siden vist sig som et kraftfuldt funktionelt genetisk værktøj i ikke-model organismer9,10. På grund af sin meget effektive karakter i nogle insekter, RNAi kan endda anvendes i skadedyrsbekæmpelse11.
Som et forskningsværktøj er RNAi blevet brugt til at undersøge, hvordan centrale molekylære udviklingsveje fungerer i utraditionelle insektmodeller. For eksempel har RNAi i melbillen Tribolium castaneum været medvirkende til at bestemme, hvor dybt bevarede gener bidrager til specifikke træk i denne bille, som eksemplificeret for udviklingen af specielt formedevinger 12,,13,14 og øjne15,16. De teknikker, der ligger til grund for manipulationer i T. castaneum er blevet godt beskrevet17 og stole på evnen til at immobilisere relativt tørre æg og larver på en klæbrig overflade. En sådan immobilisering er dog ikke muligt for de våde udviklingsformer af akvatiske organismer såsom Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Som det er tilfældet for mange utraditionelle modelorganismer, mangler det et kommenteret genom. At manipulere genekspression i enhver organisme uden et genom, en rimelig og omkostningseffektiv første skridt er at generere transkriptoer og identificere de formodede nukleotid sekvenser af de udtrykte gener af interesse baseret på sekvens lighed med beslægtede, men mere etablerede model organismer, i dette tilfælde, primært Tribolium (Coleoptera) og Drosophila gener.
Her, for at vise, hvordan RNAi kan bruges på en akvatisk organisme, diskuterer vi først protokoller og software til RNA-ekstraktion og transskriptionsgenerering og samling, som gør det muligt at identificere specifikke målrettede gensekvenser. Vi opsummerer derefter de nødvendige trin til syntetisering af genspecifik dsRNA. Efterfølgende illustrerer vi, hvordan æg kan injiceres i et vandmiljø og demonstrere inkubationsprotokoller til dyrkning af embryoner. Derudover viser vi, hvordan agarosegel kan bruges til helt at immobilisere larver under injektionsprocessen, en teknik, der generelt er nyttig under forskellige procedurer og kan anvendes på en række leddyr. For at demonstrere, hvordan RNAi kan anvendes på forskellige udviklingsstadier, inkluderer vi et eksempel, hvor vi gjorde øjet pigmenteringsgen hvidt i embryoner. Derudover beskriver vi et eksempel, hvor solariet laccase2(lac2) blev bragt til tavshed under både den anden larveinstjerne (for at påvirke larver af den tredje larve instar) og den tredje larve instar (til at påvirke voksne). Endelig viser vi, at injektionen af en lavere koncentration af dsRNA fører til delvis knockdown, hvilket viser, at denne teknik også kan anvendes på gener, hvor funktionstab vides at være dødelig.
Vores mål er, at denne samling af metoder vil gøre RNAi bredt tilgængelig, især da dette værktøj fortsat er en kraftfuld synergistisk teknik til CRISPR/Cas9-baseret genredigering, med den fordel, at det kan anvendes på de ønskede udviklingsstadier af undersøgte organismer. For at eksemplificere denne styrke injicerede vi dsRNA i embryoner og i forskellige larvestadier. Injektioner i æg påvirkede udviklingen af embryoner (figur 2), injektioner i anden larvefase havde tilsyneladende virkninger på den tredje larvefase(figur 4 og figur 6),og injektioner i tredje larvefase viste virkninger hos voksne (figur 5). Mens den nøjagtige timing skal fastlægges eksperimentelt, generelt, injektioner træder i kraft inden for et par dage. Succesen af denne proces kan påvirkes af længden af dsRNA-sekvensen. Her præsenterede vi eksempler ved hjælp af lidt over 200 bp til mere end 800 bp. Som hovedregel foretrækkes sekvenser mellem 100 og 600 bp for at begrænse off-target effekter, men sekvenser op til 1000 bp giver gode resultater22. Et spørgsmål med hensyn til RNAi er varigheden af knockdown, der kan opnås gennem denne teknik. Da fænotyperne var terminale på hvert trin, kan vi ikke kommentere dette spørgsmål baseret på vores præsenterede resultater. Det er dog tidligere blevet bemærket, at RNAi-effekter generelt er relativt lange, og at højere koncentrationer fører til længerevarende knockdowns20.
En begrænsning af denne teknik er, at det virker bedre for nogle organismer end for andre, og der synes at være nogen direkte måde at forudsige, hvor godt det vil arbejde a priori. Ikke desto mindre har det vist sig at fungere godt for en lang række forskellige organismer. Inden for leddyr, dette omfatter arachnids26, krebsdyr27, og en række insekter, med særligt høje succesrater i biller28. En yderligere komplikation er, at forskelle i fænotype sværhedsgrad ofte forekommer mellem enkeltpersoner på trods af anvendelsen af den samme mængde dsRNA. Som illustreret i figur 2Bkan variation endda forekomme inden for en person. I vores RNAi undersøgelser rettet mod forskellige gener, der er involveret i T. marmoratus larve øjenudvikling, har vi ofte konstateret, at nogle øjne er påvirket mere alvorligt end andre. Dette fænomen kan være relateret til det relativt tætte væv i øjenklyngen, med dsRNA bedre i stand til at nå nogle af enhederne.
For en vellykket udførelse af RNAi eksperimenter, er det afgørende, at flere parametre er optimeret til målet genet. For eksempel kan koncentrationen af dsRNA og længden af det målrettede gen i høj grad påvirke resultatet20. En anden kritisk parameter er, hvordan injektionerne udføres, da denne proces i høj grad kan påvirke overlevelsesraten. For embryoner opnåede vi de bedste resultater ved at målrette embryonets centrum. En velindlagt plade giver mulighed for injektion af 100 eller flere embryoner i en enkelt session. For larver er det vigtigt at indsætte injektionsnålen mellem segmenterne. Disse injektioner kræver mere dsRNA, og baseret på larver tilgængelighed, vores injektion sæt her typisk kun bestod af et par dyr ad gangen. For alle injektioner er det afgørende at forhindre luft i at trænge ind i organismen.
I nogle tilfælde kan feedback loops af et genregulerende netværk og genetisk redundans påvirke penerance af RNAi fænotyper, på trods af konsekvent knockdowns. Dette synes at være tilfældet for vores adfærdsmæssige observationer af larver med meget vellykket knockdowns af en fremtrædende linse protein, Lens318. Selv om vi verificerede den høje effektivitet af disse knockdowns gennem qPCR, blev der observeret betydelige variationer i de tilknyttede fænotyper. Dette resultat understreger nødvendigheden af korrekt kvantificering af RNAi knockdowns (for nærmere oplysninger om muligheder se22). Hvis der ikke er nogen klar a priori forventning med hensyn til de resulterende fænotyper, en god måde at kontrollere for off-target effekter af RNAi er at målrette det samme gen med to ikke-overlappende sekvenser af dsRNA og til at evaluere resultaterne for fælles fænotyper.
I modsætning til genredigeringsteknikker er RNAi også et effektivt værktøj til at studere dødelige gener, og der er to måder at gøre det på. For eksempel, hvis man er interesseret i det funktionelle bidrag fra et gen, hvor tab af funktion tidligt i udviklingen er kendt for at være dødelig, kan en funktionel undersøgelse af et sådant gen opnås ved blot at lade dyret udvikle sig normalt og derefter vælte genet via RNAi senere i udvikling (dvs. i den voksne). Alternativt kan et gen, hvor fuldstændig funktionstab er kendt for at være dødeligt, undersøges gennem en delvis knockdown, hvilket kan opnås ved at indsprøjte en række dsRNA-koncentrationer. Nogle af vores resultater viser knockdowns af lac2, som er kendt for at være dødelig, hvis neglebånd i insekter bliver alt for blød24. Selv lac2 RNAi billen afbildet i figur 5 ville være usandsynligt, at overleve uden for laboratorieforholdene. Et andet dødeligt gen er skåret, hvilke koder for en transskription faktor , der er afgørende for celle-skæbne specifikation i forskellige organsystemer i leddyr og har været knyttet til glia udvikling i Drosophila visuelle system29. Baseret på vores erfaring med cut RNAi i T. marmoratus embryoner, kan vi fremkalde informative øje fænotyper i embryoner, der er i stand til at fuldføre deres embryonale øje udvikling (ikke-offentliggjorte observationer). Her, højere doser synes at føre til højere dødelighed satser, mens lavere doser resultere i observerbare og informative fænotyper.
Vores protokol ikke kun lister de nødvendige skridt for en forsker til at forfølge RNAi eksperimenter på T. marmoratus, som illustreret, men også er generelt gælder for andre organismer, især vandorganismer. Blandt vandorganismer er der allerede flere eksempler inden for krebsdyr såsom vandloppe Dafnierne30 og rejer (se reference31for nylig). Der er rigelige muligheder blandt vandinsekter, da de er blevet anslået til at omfatte omkring 6% af alle insekt mangfoldighed, med sandsynligvis mere end 200.000 arter32. Desuden er RNAi allerede blevet udført på vand striders, der har tendens til at bebo overfladen af vandmiljøer33. Hvis der ikke er noget genom til stede, kan der samles en transskription de novo. Så længe denne proces afslører contigs af et par hundrede nukleotider, dsRNA mod specifikke gener kan designes. Vores protokol for immobilisering af insekter i agarose vil sandsynligvis også være nyttig for andre procedurer, især for bløde, formbare og akvatiske organismer. Tilsammen er RNAi stadig en kraftfuld teknik til at manipulere genekspression i en forskelligartet gruppe af organismer, selv når der ikke findes andre molekylære og genetiske værktøjer.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Josh Benoit for hans hjælp med bioinformatik Hailey Tobler for hendes hjælp til at hæve Sunburst Dykning Biller og Tamara Pace for redaktionel bistand. Denne forskning blev støttet af National Science Foundation under tilskud IOS-1456757 og IOS-1856341 til EKB og IOS1557936 til YT.
1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
injection buffer (10x) | See section 4 | ||
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |