Qui, presentiamo un metodo per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) nei topi usando una tecnica nota come DC-ENG descritta per la prima volta da Marmorstein, Peachey e colleghi nei primi anni 2000.
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Articolo metodologico
Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato specializzato di cellule strategicamente situate tra la retina e il coriocapillaris che mantengono la salute generale e l'integrità strutturale dei fotorecettori. L'RPE è polarizzato, esibendo recettori o canali localizzati in modo apico e basale, ed esegue il trasporto vettoriale di acqua, ioni, metaboliti e secenere diverse citochine.
Le misurazioni nonive in vivo della funzione RPE possono essere effettuate utilizzando ENG ad accoppiamento diretto (DC-ENG). La metodologia alla base del DC-ERG è stata introdotta da Marmorstein, Peachey e colleghi che utilizzano un sistema di registrazione della stimolazione personalizzato e in seguito ha dimostrato di utilizzare un sistema disponibile in commercio. La tecnica DC-ERG utilizza capillari di vetro riempiti con la soluzione di sale tamponato (HBSS) di Hank per misurare le risposte elettriche più lente dell'RPE suscitate dai cambiamenti di concentrazione evocati dalla luce nello spazio subretinale a causa dell'attività del fotorecettore. Lo stimolo luminoso prolungato e la lunghezza della registrazione DC-ERG lo rendono vulnerabile alla deriva e al rumore con conseguente bassa resa di registrazioni utilizzabili. Qui presentiamo un metodo rapido e affidabile per migliorare la stabilità delle registrazioni riducendo al contempo il rumore utilizzando la pressione del vuoto per ridurre / eliminare le bolle derivanti dal degassamento dell'HBSS e del supporto per elettrodi. Inoltre, gli artefatti della linea elettrica vengono attenuati utilizzando un regolatore di tensione / condizionatore di potenza. Includiamo i protocolli di stimolazione della luce necessari per un sistema ERG disponibile in commercio e script per l'analisi dei componenti DC-ERG: onda c, oscillazione rapida, picco di luce e risposta off. Grazie alla migliore facilità di registrazione e al flusso di lavoro di analisi rapida, questo protocollo semplificato è particolarmente utile per misurare i cambiamenti legati all'età nella funzione RPE, nella progressione della malattia e nella valutazione dell'intervento farmacologico.
Introduzione
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule specializzate che allineano il segmento posteriore dell'occhio ed esercitano funzioni critiche per mantenere l'omeostasi retinica1. L'RPE supporta i fotorecettori rigenerando il loro pigmento visivo che cattura fotoni in un processo chiamato ciclovisivo 2,partecipando alla fagocitosi diurna delle punte del segmentoesterno capannone 3,e nel trasporto di nutrienti e prodotti metabolici tra fotorecettori e coriocapillaris4,5. Le anomalie nella funzione RPE sono alla base di numer....
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali delineate nel protocollo di studio sugli animali approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del National Eye Institute.
1. Importazione di protocolli di stimolazione della luce per DC-ERG
NOTA: Seguire le istruzioni riportate di seguito per importare i protocolli di stimolazione della luce per il DC-ERG nel software del sistema ERG(Table of Materials). Il protocollo consiste in un intervallo di pre-stimolo di 0,5 minuti, seguito da un passo di luce (10 cd/m2) per 7 minuti, e termina con un intervallo post-stim....
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Risultati
La figura 2 è un set di dati di esempio di mouse miR-204 ko/ko cre/+ (KO condizionale) e di tipo selvaggio (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sono topi con un knockout condizionale di microRNA 204 nell'epitelio pigmentato retinico. Questi topi sono generati incrociando topi miR-204 floxed (prodotti da NEIGEF)22 con topi VMD2-CRE23. MiR-204 è altamente espresso nell'RPE dove regola l'espressione di proteine critiche per la funzione epiteliale che manteng.......
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Discussione
Passaggi critici
Una buona registrazione DC-ERG richiede elettrodi stabili che sono liberi da bolle che creano artefatti e deriva indesiderata in quanto sono estremamente sensibili al degassamento e alle variazioni di temperatura. È essenziale che si ottiene una linea di base stabile quando gli elettrodi vengono posizionati nella soluzione da bagno HBSS prima di procedere con la registrazione del mouse. Piccole bolle tendono a raccogliere alla base dell'elettrodo capillare o i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi intramurali NEI. Gli autori riconoscono sinceramente il Dr. Sheldon Miller per la sua guida scientifica, consulenza tecnica e competenza nella fisiologia e nelle malattie RPE. Gli autori ringraziano Megan Kopera e lo staff di cura degli animali per la gestione delle colonie di topi, e il Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang per il supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ag/AgCl (bocca) | Elettrodo WPI Inc | EP1 | Elettrodo di riferimento per bocca per topo |
| Piastrelle in ceramica | Strumento Sutter | CTS | Utilizzato per tagliare il tubo capillare di vetro a una dimensione appropriata |
| Bastone di pulizia con punta in cotone | Puritan Medical Products | 867-WC Senza colla | Da utilizzare come distanziatore per migliorare l'adattamento del gruppo portaelettrodo |
| Sistema Elettroretinogramma (ERG) | Sistema E3 di Diagnosys LLC | Sistema di elettrofisiologia visiva per diagnosticare le condizioni oftalmiche nella ricerca sulla vista e nelle sperimentazioni farmacologiche | |
| Bruciatore Bunsen | Argos Technologies | BW20002460 | O equivalente per modellare il vetro sotto fiamma |
| Tubo capillare in vetro (1,5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | Per il riempimento con HBSS e il contatto con la cornea |
| Hank' s Soluzione salina tamponata (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Disponibile in commercio. Manutenzione presso RT |
| Filtro in linea | Whatman | 6722-5001 | Per proteggere la pompa a vuoto dagli aerosol |
| Cavo a bassa rumorosità per supporti per microelettrodi | WPI Inc | 5372 | Consigliato per migliorare la lunghezza e il posizionamento dei cavi e dei gruppi portaelettrodo |
| Giunto sferico magnetico | WPI Inc | 500871 | Per posizionare magneticamente il gruppo portaelettrodo sul tavolino |
| MatLab | Mathworks | MatLab: per la modifica del software di analisi | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (necessario solo per la modifica del software di analisi) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (necessario solo per la modifica e il rilascio del software di analisi) | |
| MatLab Runtime versione 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Necessario per eseguire il software di analisi: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Supporti per microelettrodi (45 gradi) | WPI Inc | MEH345-15 | Per tenere i capillari |
| Ago (25 ga) | Covidien | 8881250313 | Per riempire i tubi capillari con ago HBSS |
| (rettificato) Elettrodo | Rhythmlink | 13mm - un elettrodo | Elettrodo ad ago sottocutaneo (rettifica) per topo (13 mm di lunghezza, ago di 0,4 mm di diametro, cavo da 1,5 m) |
| Regolatore/condizionatore di potenza | Furman | P-1800 | O equivalente per rimuovere l'offset CC dal rumore introdotto attraverso la linea di alimentazione |
| Siringa (12 mL) | Monoject 1181200777 | Per riempire i tubi capillari con clip a T HBSS | |
| Cole-Parmer | 06852-20 | Per il montaggio del portaelettrodo | |
| Essiccatore sottovuoto | Bel-Art | 420120000 | Fondo e coperchio |
| Trattamento farmacologico | |||
| Lubrificante gel oculare | Alcon | 0078-0429-47 | Aiuta a lubrificare la superficie corneale e a mantenere il contatto elettrico con gli elettrodi capillari |
| Fenilefrina cloridrato 2,5% | Akorn | 17478-201-15 | Collirio midriatico a breve durata d'azione (per la dilatazione della pupilla) |
| Proparacaina cloridrato 0,5% | Akorn | 17478-263-12 | Anestetico locale per instillazione oftalmica |
| Tropicamide 0,5% | Akorn | 17478-101-12 | Collirio midriatico a breve durata d'azione (per la dilatazione della pupilla) |
| Xilazina | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesico e miorilassante |
| Zetamina (Ketamina HCl) | VetOne | 501072 | Anestetico per iniezioni intramuscolari |
Riferimenti
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in....
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Ristampe e permessi
