Method Article

Прямая электроретинограмма (DC-ERG) для записи световых электрических реакций мыши Сетчатки Пигмент Эпителий

DOI:

10.3791/61491

⸱

July 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Retinal Neurophysiology Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 2Ocular and Stem Cell Translational Research Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 3Human Visual Function Core, National Eye Institute, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод записи световых электрических реакций эпителия пигмента сетчатки (RPE) у мышей с использованием метода, известного как DC-ERGs, впервые описанного Марморштейном, Пичи и его коллегами в начале 2000-х годов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является специализированным монослой клеток, стратегически расположенных между сетчаткой и choriocapillaris, которые поддерживают общее здоровье и структурную целостность фоторецепторов. RPE поляризуется, экспонирует апсически и базально расположенные рецепторы или каналы, и выполняет векторную транспортировку воды, ионов, метаболитов и выделяет несколько цитокинов.

Неинвазивные измерения функции RPE in vivo могут быть сделаны с использованием непосредственно связанных ERG (DC-ERG). Методология, стоящая за DC-ERG, была впервые разработана Марморштейном, Пичи и его коллегами с помощью специально построенной системы записи стимуляции, а затем продемонстрирована с использованием коммерчески доступной системы. Техника DC-ERG использует стеклянные капилляры, наполненные буферным соленым раствором Хэнка (HBSS), для измерения более медленных электрических реакций RPE, вызванных изменениями концентрации в подретинном пространстве из-за активности фоторецептора. Длительный световой стимул и длина записи DC-ERG делают его уязвимым для дрейфа и шума, что приводит к низкой урожайности годных к использованию записей. Здесь мы представляем быстрый и надежный метод повышения стабильности записей при одновременном снижении шума с помощью вакуумного давления для уменьшения/устранения пузырьков, которые являются результатом выброса HBSS и держателя электрода. Кроме того, артефакты линии электропередачи затухают с помощью регуляторов напряжения/кондиционера. Мы включаем необходимые протоколы стимуляции света для коммерчески доступной системы ERG, а также скрипты для анализа компонентов DC-ERG: c-волна, быстрое колебание, световой пик и реакция. Благодаря улучшенной простоте записей и быстрому анализу рабочего процесса, этот упрощенный протокол особенно полезен для измерения возрастных изменений в функции RPE, прогрессирования заболевания, а также в оценке фармакологического вмешательства.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является монослой специализированных клеток, которые высовывает задний сегмент глаза и оказывают критические функции для поддержания гомеостазасетчатки 1. RPE поддерживает фоторецепторы путем регенерации их фотон захвата визуального пигмента в процессе, называемомвизуальный цикл 2, участвуя в диурнальный фагоцитоз пролить внешнийсегмент советы 3, и в транспортировке питательных веществ и метаболических продуктов между фоторецепторами и choriocapillaris4,5. Аномалии в функции RPE лежат в основе многочисленны....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует руководящим принципам по уходу за животными, изложенным в протоколе исследования животных, утвержденном Комитетом по уходу за животными и использованию Национального института глаз.

1. Импорт протоколов стимуляции света для DC-ERG

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте указаниям ниже, чтобы импортировать протоколы стимуляции света для DC-ERG в программное обеспечение системы ERG(Таблица материалов). Протокол состоит из 0,5 мин предварительно стимул интервал, а затем шаг света (10 cd/m2) в течение 7 минут, и заканчивая 1,5 мин после стимула интервал. Интенсивность света 10 cd/m2<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2 — выборочный набор данных мышей miR-204 ko/ko cre/' (условный KO) и диких мышей типа (WT). MiR-204 ko/ko cre/ - это мыши с условным нокаутом микроРНК 204 в эпителии пигмента сетчатки. Эти мыши генерируются путем скрещивания floxed miR-204 мышей (производится NEIGEF)22 с VMD2-CREмышей 23. MiR-204 высоко выражен в RPE, где он регулирует экспрессию белков, критически важных для эпителиальной функции, которые поддерживают плотную целостно.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги

Хорошая запись DC-ERG требует стабильных электродов, которые свободны от пузырьков, которые создают артефакты и нежелательный дрейф, поскольку они чрезвычайно чувствительны к outgassing и изменения температуры. Очень важно, чтобы стабильный базовый уровень достигается, когда электроды помещаются в раствор ванны HBSS, прежде чем двигаться вперед с записью мыши. Небольшие пузырьки, как правило, собирают у основания капиллярного электрода или вокруг силиконовой п.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана интрамуральными фондами НЭИ. Авторы искренне признают д-р Шелдон Миллер за его научные рекомендации, технические консультации, и опыт в области физиологии RPE и болезней. Авторы благодарят Меган Копера и персонал по уходу за животными за управление колониями мышей, а также доктора Таруна Бансала, Раймонда Чжоу и Yuan Wang за техническую поддержку.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl (рот) ЭлектродWPI IncEP1Ротовой электрод сравнения для мыши
Керамическая плиткаИнструмент Саттера CTSИспользуется для разрезания стеклянной капиллярной трубки до соответствующего размера
Палочка для чистки с ватным наконечникомPuritan Medical Products867-WC Без клеяИспользуется в качестве прокладки для улучшения прилегания электрододержателя в сборе
Система электроретинограммы (ERG)Diagnosys LLCE3 SystemСистема визуальной электрофизиологии для диагностики офтальмологических состояний в исследованиях зрения и испытаниях лекарств
Bunsen BurnerArgos TechnologiesBW20002460Или эквивалент формы стекла под пламенем
Стеклянная капиллярная трубка (1,5 мм)Sutter InstrumentsBF150-75Для наполнения HBSS и контакта с роговицей
Ганка s Буферный раствор соли (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Коммерчески доступен. Обслуживание в RT
Встроенный фильтрWhatman6722-5001Для защиты вакуумного насоса от аэрозолей
Малошумящий кабель для держателей микроэлектродов WPIInc5372Рекомендуется для улучшения длины и размещения кабелей и электрододержателей в сборе
Магнитный шаровой шарнирWPI Inc500871Для магнитного позиционирования электродов в сборе на сцене
MatLabMathworksMatLab: Для редактирования программного обеспечения для анализа
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox для MatLab (требуется только для редактирования программного обеспечения для анализа)
Компилятор MatLabMathworksToolbox для MatLab (требуется только для редактирования и повторного выпуска программного обеспечения для анализа)
MatLab Runtime версия 9.5MathworksR2018b (9.5)Необходимые для запуска программного обеспечения для анализа: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Держатели микроэлектродов (45 градусов)WPI IncMEH345-15Для удержания капилляров
Игла (25 ga)Covidien8881250313Для наполнения капиллярных трубок HBSS
Игла (заземленная) ЭлектродRhythmlink13мм - один элктродПодкожный игольчатый электрод (заземление) для мыши (длина иглы 13 мм, диаметр 0,4 мм, подводящий провод 1,5 м)
Регулятор/стабилизатор питанияFurmanP-1800Или эквивалент для удаления смещения постоянного тока от шума, подаваемого через линию электропередачи
. Шприц (12 мл)Монопроект1181200777Для заполнения капиллярных трубок с помощью HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20Для сборки держателя электрода
Вакуумный эксикаторBel-Art420120000Прозрачное дно и крышка
<прочный>Фармакологическое лечение
Гель-смазка для глазAlcon 0078-0429-47Помогает смазывать поверхность роговицы и поддерживать электрический контакт с капиллярными электродами
Фенилэфрина гидрохлорид 2.5%Akorn17478-201-15Мидриатические глазные капли короткого действия (для расширения зрачка)
Пропаракаина гидрохлорид 0.5%Akorn17478-263-12Местный анестетик для офтальмологической инстилляции
Тропикамид 0.5%Akorn17478-101-12Мидриатические глазные капли короткого действия (для расширения зрачка)
XylazineAnaSedsc-362949RxАнальгетик и миорелаксант
Зетамин (Кетамин гидрохлоридВетон501072Анестетик для внутримышечных инъекций
из поликарбоната)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Coupled ERGRetinal Pigment EpitheliumMouse RPE FunctionLight Evoked ResponsesCapillary Electrode PreparationHBSS Filled CapillariesElectrode Impedance TestingPhotoreceptor ActivityC Wave AnalysisAge Related RPE Changes

Related Articles