מתודולוגיה זו שואפת להעריך ציטוטוקסיות של חומרים ביולוגיים באמצעות הכנת תמציות מסיסות, תוך שימוש במבחני כדאיות וניתוח פנוטיפי, כולל ציטומטריית זרימה, RT-PCR, אימונוציטוכימיה וטכניקות ביולוגיה תאית ומולקולרית אחרות.
ביו-חומרים באים במגע ישיר או עקיף עם רקמות האדם, ולכן חשוב להעריך את ציטוטוקסיותו. הערכה זו יכולה להתבצע במספר שיטות, אך קיים פער גבוה בין הגישות בהן נעשה שימוש, מה שפוגע ביכולת השחזור וההשוואה בין התוצאות המתקבלות. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול להערכת ציטוטוקסיות של ביו-חומרים באמצעות תמציות מסיסות, שבהן אנו משתמשים עבור ביו-חומרים דנטליים. הכנת התמציות מפורטת, החל מייצור הכדוריות ועד מיצוין במדיום תרבית. הערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרים מבוססת על פעילות מטבולית באמצעות בדיקת MTT, כדאיות התא באמצעות בדיקת Sulphorhodamine B (SBR), פרופיל מוות תאי באמצעות ציטומטריית זרימה, ומורפולוגיה של התא באמצעות May-Grünwald Giemsa. בנוסף להערכת ציטוטוקסיות, פרוטוקול להערכת תפקוד התא מתואר בהתבסס על ביטוי של סמנים ספציפיים המוערכים על ידי אימונוציטוכימיה ו- PCR. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לציטוטוקסיות של ביו-חומרים ולהערכת השפעות תאיות, תוך שימוש במתודולוגיית התמציות, באופן ניתן לשחזור וחזק.
תאימות ביולוגית יכולה להיות מוגדרת כיכולת של חומר לשלב רקמות ולגרום לתגובה טיפולית חיובית, ללא נזקים מקומיים וסיסטמיים 1,2,3. הערכת תאימות ביולוגית חיונית לפיתוח כל חומר המיועד לשימוש רפואי. לכן, פרוטוקול זה מספק גישה שיטתית ומקיפה לכל חוקר השואף לפתח ביו-חומרים חדשים או לחקור יישומים חדשים לביו-חומרים קיימים.
בדיקות ציטוטוקסיות במבחנה נמצאות בשימוש נרחב כשלב הראשון להערכת תאימות ביולוגית, באמצעות תרביות תאים ראשוניות או קווי תאים. התוצאות מהוות אינדיקטור ראשון ליישום קליני פוטנציאלי. מלבד היותה חיונית לפיתוח ביו-חומרים, בדיקה זו היא חובה כדי לעמוד בתקנות הנוכחיות להחדרת שוק, מהרגולטורים של EUA והאיחוד האירופי (אישור FDA ו- CE) 4,5,6,7,8. יתר על כן, בדיקות סטנדרטיות במחקר ביו-רפואי מספקות יתרון משמעותי במונחים של שחזור והשוואת תוצאות ממחקרים שונים על ביו-חומרים או מכשירים דומים9.
הנחיות ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) נמצאות בשימוש נרחב על ידי מעבדות מסחריות, רגולטוריות ואקדמיות עצמאיות רבות לבדיקת חומרים באופן מדויק וניתן לשחזור. ISO 10993-5 מתייחס להערכת ציטוטוקסיות חוץ גופית ודוחות ISO 10993-12 להכנת דגימה10,11. לבדיקות ביו-חומרים ניתנות שלוש קטגוריות, שייבחרו בהתאם לסוג החומר, רקמות המגע ומטרת הטיפול: תמציות, מגע ישיר ומגע עקיף 8,11,12,13. תמציות מתקבלות על ידי העשרת מדיום תרבית תאים עם החומר הביולוגי. עבור בדיקות מגע ישיר, החומר הביולוגי ממוקם ישירות על תרביות התא, ובמגע עקיף, הדגירה עם התאים מתבצעת מופרדת על ידי מחסום, כגון ג’ל אגרוז11. בקרות מתאימות הן חובה, ויש לבצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים 5,8,10,11,14.
זה קריטי לדמות או להגזים בתנאים קליניים כדי לקבוע את הפוטנציאל ציטוטוקסי. במקרה של בדיקת תמציות, שטח הפנים של החומר; הנפח הבינוני; המדיום וה- pH החומרי; מסיסות החומר, האוסמולריות ויחס הדיפוזיה; ותנאי המיצוי כגון תסיסה, טמפרטורה וזמן משפיעים על מעשרת המדיה5.
המתודולוגיה מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של ציטוטוקסיות של מספר פורמולציות פרמצבטיות, הן מוצקות והן נוזליות. ניתן לבצע מספר בדיקות, כגון בדיקת ספיגה אדומה ניטרלית, בדיקת היווצרות מושבה, בדיקת MTT ובדיקת XTT 5,10,14.
רוב מחקרי הערכת ציטוטוקסיות שפורסמו משתמשים בבדיקות פשוטות יותר, כלומר MTT ו- XTT, המספקות מידע מוגבל. הערכת תאימות ביולוגית צריכה לכלול לא רק הערכה של ציטוטוקסיות אלא גם פעילות ביולוגית של חומר בדיקה נתון2, כפי שפרוטוקול זה מאשר. יש להשתמש בקריטריונים נוספים להערכה כאשר הם מוצדקים ומתועדים. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לספק מדריך מקיף, המפרט סדרה של שיטות להערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרית. חוץ מזה, הערכה של תהליכים תאיים שונים, כלומר סוג של מוות התא, מורפולוגיה של התא, תפקוד התא בסינתזה של חלבונים ספציפיים, וייצור רקמות ספציפיות, מתוארים.
פרוטוקול זה תוכנן תוך התחשבות ב- ISO 10993-5, המתייחס להערכת ציטוטוקסיות במבחנה של ביו-חומרים הבאים במגע עם הרקמות, כדי להעריך את התאימות הביולוגית ולתרום לשכפול מחקרים21. זהו חשש גובר במדע, ומחברים רבים כבר עוקבים אחר המלצות אלה בתכנון הניסוי של מחקריהם במבחנה 15,22,23,24,25,26,27,28<…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לגורמים הבאים על התמיכה: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB ממומן על ידי קרנות לאומיות באמצעות FCT (הקרן למדע וטכנולוגיה) באמצעות הפרויקט האסטרטגי UIDB/04539/2020 ו- UIDP/04539/2020 (CIBB). אנו מודים לז’אק נור, בית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת מישיגן, על אספקת קו התאים MDPC-23.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
DAB + Chromogen | Dako | K3468 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Giemsa Stain, modified GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
Glycerol | Dako | C0563 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
May-Grünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 | Dako | G-21234 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Substrate Buffer | Dako | 926605 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
β-actin antibody | Sigma | A5316 |