En protokol præsenteres, der giver mulighed for visualisering af intakt Drosophila melanogaster på ethvert udviklingsstadium ved hjælp af mikrocomputeret tomografi.
Biomedicinske billeddannelsesværktøjer gør det muligt at undersøge molekylære mekanismer på tværs af rumlige skalaer, fra gener til organismer. Drosophila melanogaster, en velkarakteriseret modelorganisme, har nydt godt af brugen af lys- og elektronmikroskopi til at forstå genfunktion på niveau med celler og væv. Anvendelsen af billeddannelsesplatforme, der giver mulighed for en forståelse af genfunktion på hele den intakte organisme, vil yderligere øge vores viden om genetiske mekanismer. Her præsenteres en hel dyrebilleddannelsesmetode, der skitserer de trin, der er nødvendige for at visualisere Drosophila på ethvert udviklingsstadium ved hjælp af mikrokompliceret tomografi (μ-CT). Fordelene ved μ-CT omfatter kommercielt tilgængelige instrumentering og minimal hands-on tid til at producere nøjagtige 3D-oplysninger på mikron-niveau opløsning uden behov for væv dissektion eller clearing metoder. Parret med software, der fremskynder billedanalyse og 3D-rendering, detaljeret morfometrisk analyse af ethvert væv eller organsystem kan udføres for bedre at forstå mekanismer for udvikling, fysiologi og anatomi for både beskrivende og hypotese test undersøgelser. Ved at udnytte en billeddannelse arbejdsgang, der inkorporerer brugen af elektronmikroskopi, lysmikroskopi, og μ-CT, en grundig evaluering af genfunktion kan udføres, hvilket fremmer nytten af denne kraftfulde model organisme.
Billeddannelsesmetoder, der giver mulighed for en detaljeret undersøgelse af indvendige strukturer af et objekt uden at ødelægge dets overordnede 3D-arkitektur, har vist sig at være meget gavnlige for en række forskellige discipliner, herunder fysik, teknik, materialevidenskab, arkæologi, palæontologi, geologi ogbiologi 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Blandt disse ikke-destruktive billeddannelsesmetoder er røntgenbaserede platforme især nyttige på grund af højenergi røntgenstrålernes evne til at trænge ind i mange forskellige prøvetyper og materialer med minimal spredning sammenlignet med synlige lysbølger. Computertomografi (CT), Mikrokompliceret tomografi (μ-CT), Nanocomputed Tomography (Nano-CT) og Synkrotronmikrotomografi har derfor vist sig som de primære teknologier til røntgenbaseret billeddannelse af prøver lige fra meter til mikron, med millimeter til submikronopløsningskapacitet10,11,12,13,14.
Mens disse platforme adskiller sig i deres design, røntgengeometri og komponenter for at afbalancere prøvestørrelse og opløsning, er de alle afhængige af det samme grundlæggende princip for billedoptagelse: en kilde til røntgenstråler, der rejser gennem objektet og fanges af en detektor. Differentialdæmpning af røntgenstrålen, når den passerer gennem forskellige tætheder i objektet, genererer billedkontrast. 3D-data opnås ved at rotere enten prøven eller detektoren, indsamle en række 2D-projektionsbilleder, der derefter rekonstrueres ved hjælp af algoritmer, til tomogrammer, der indeholder 3D-oplysninger, hvis opløsning er isotropisk i x,y,z15. For mange bordplade μ-CT-scannere, der udnytter en kegle-beam X-ray geometri til projektet røntgenstråler på det objekt, der afbildes, Feldkamp algoritme bruges til præcist at rekonstruere objektet med minimal fejl16.
Opløsningen af en given platform bestemmes primært af systemparametre som størrelsen af røntgenstrålen (spotstørrelse), scannergeometri (afstand fra objekt til røntgenkilde), størrelsen af pixels på detektoren og den anvendte rekonstruktionsalgoritme. Yderligere faktorer, såsom scannervibrationer, udsving i røntgenstrålen, prøvebevægelser og materialetype eller kemisk plet, der bruges til at visualisere objektet, kan også påvirke rumlig opløsning betydeligt under billeddannelser i den virkelige verden15.
Til biomedicinske applikationer har CT og μ-CT spillet en central rolle i at fremme vores forståelse af anatomi, fysiologi, udvikling og sygdomsmekanismer, der tjener som et værktøj til både menneskelige patientdiagnoser og som en præklinisk billeddannelsesplatform for modelorganismer17,18. For eksempel bruger Mouse International Phenotyping Consortium, hvis mål er at identificere funktionen af hvert gen i musegenomet, μ-CT som en del af deres phenotyping pipeline19. Deres resultater har været afgørende for at forstå gener involveret i udvikling og sygdomsprocesser, samtidig med at de tjener som atlas for mus anatomi og udvikling20. Andre modelorganismer, såsom zebrafisk og rotter, har også fuldt ud taget brugen af μ CT til udførelse af hele dyr phenotyping af en række gen mutanter17,21,22,23.
Fordelen ved at kombinere hele dyrebilleddannelse med modelorganismer er, at en mekanistisk forståelse af genfunktion for en given biologisk proces kan udforskes fuldt ud. Dette er muligt på grund af de velkarakteriseret genomer og mange genetiske værktøjer til rådighed i modelorganismer, der giver mulighed for præcis manipulation af genfunktion på forskellige udviklingstidspunkter, specifikke væv, individuelle celler og endda subcellulære organeller. Disse omfatter binære udtrykssystemer som UAS/GAL4-systemet (og dets mange derivater), CRISPR/Cas9 og RNAi24,25,26. Når disse genetiske værktøjer anvendes sammen med en kraftig billeddannelsespipeline bestående af elektronmikroskopi, lysmikroskopi (fluorescerende og ikke-fluorescerende) og hele dyrs billeddannelse som μ-CT, kan der opnås en grundig evaluering af molekyler, celler, væv, organer og hele organismen, hvilket giver mulighed for en meget dybere forståelse af genfunktion.
Denne protokol fokuserer på brugen af μ-CT i den ikke-pattedyrsmodelorganisme Drosophila melanogaster, hvis utallige genetiske værktøjer har hjulpet med at belyse mange molekylære mekanismer26,27. Det blev vedtaget fra tidligere protokoller i ikke-model insekter1,28,29,30,31,32, og bygger ud af tidligere μ-CT-undersøgelser i Drosophila at etablere en standardiseret protokol til dens anvendelse i dette dyr33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Trinnene til vellykket prøveforberedelse, billedbehandling og analyse af μ-CT-datasæt ved hjælp af kommercielt tilgængelige scannere er skitseret. Med denne protokol kan alle udviklingsstadier af fluen visualiseres ved høj opløsning til både beskrivende og hypotese-test undersøgelser, herunder taksonomi, anatomi, udvikling, fysiologi og sygdom27. Denne protokol vil også være nyttig til billeddannelse stort set alle insekt og endda ikke-levende materialer, der kræver kemisk farvning for billede kontrast til at forbedre visualisering ved μ-CT.
Visualisering intakt Drosophila melanogaster på alle udviklingsstadier er forblevet en udfordring, primært på grund af uforeneligheden af lysmikroskopi med den tykke, pigmenterede kutikula, der findes i dette dyr. Mens andre hele dyr imaging metoder, såsom Magnetic Resonance Imaging (MR), Optisk Sammenhæng Tomografi (OKT), og ultramikroskopi kombineret med væv clearing er blevet brugt med succes i fluer50,51,52,53,54, μ-CT præsenterer en række fordele, der gør det ideelt for hele dyr imaging af denne organisme13,15,30 . Røntgenstråler trænger let ind i pigmenteret kutikula, og deres lille bølgelængde giver mulighed for submikronbilleddannelse. Mærkning kræver minimal investering i bredt tilgængelige kemikalier og ingen specialiserede bænk færdigheder13. μ-CT-scannere er også kommercielt tilgængelige, og omkostningerne kan sammenlignes med lette mikroskopiplatforme, samtidig med at de er mere attraktive for bredere vifte af discipliner (geologi, palæontologi, teknik osv.), der også kan drage fordel af dens tilgængelighed på en institution. Synkrotron X-Ray kilder kan også bruges til høj opløsning μ-CT-billeddannelse af faste og levende insekter31,55,56, men er mindre tilgængelige end kommercielle benchtop scannere.
Denne protokol giver en effektiv måde at opnå μ CT-billeder af flyve voksne, pupper, larve og cellulære embryoner. Bemærk, at for mange af de trin, der er skitseret ovenfor, kan alternative metoder også anvendes til at forberede prøver til billeddannelse. Andre undersøgelser har givet en detaljeret sammenligning af forskellige fikserings-, mærknings – og tørretrin til brug i insekter , og de, der er interesseret i at anvende denneteknik,opfordres til at vurdere fordelene ved hver tilgang1,4,13,29,30,57. Mens denne protokol er relativt ligetil, præsenteres et par nyttige forslag.
For det første skal man være forsigtig, når man forstyrrer neglebånd af intakte prøver, således at underliggende blødt væv ikke forstyrres væsentligt. Det er vigtigt at lade larve og tidlige pupal stadier gennemgå fiksering i 2 timer i Bouins opløsning, før du stikker. Dette vil stivne vævet og begrænse mængden af hæmolymfe, der vil ose ud af neglebåndshullerne, hvilket kan ændre orgelarkitekturen. Individuelle kropssegmenter (hoved, brystkasse og mave) af den voksne kan adskilles, hvis strukturen (erne) af interesse er placeret der. Det anbefales at bruge en skalpel til rent at skære gennem disse segmenter i stedet for at trække dem fra hinanden med sammentrækninger, hvilket kan forstyrre 3D-arkitekturen i tarmen eller centralnervesystemet, for eksempel. Hvad angår timing, behøver voksne generelt kun 16 timer. for fuldstændig fiksering, mens larve- og pupalstadier skal 24 timer. Hvis jod- eller PTA-farvningen ser ujævn ud, kan prøven også placeres tilbage i opløsning for at inkubere længere, indtil der er opnået selv farvning. Endelig bør hydrerede prøver ikke placeres ved 4 °C, da dette synes at fremkalde dannelse af luftbobler i kroppens hulrum efter opvarmning til stuetemperatur.
For det andet vil prøvemonteringen variere efter instrument, trintype, og om prøven skal forblive hydreret eller har været kritisk punkttørret. Hvis prøven er hydreret, skal den ikke lækkes og eventuelt ødelægge scanneren. Når prøven monteres inde i en pipettespids, skal du sørge for at skubbe forsigtigt med en sløvet genstand, indtil prøverne møder let modstand og ikke kan bevæge sig. Skubbe for hårdt kan føre til neglebånd deformation og underliggende strukturelle defekter. Sørg også for, at prøven er justeret i holderen så tæt på rotationsaksen som muligt. Enhver wobble vil øge scanning gange på grund af det større synsfelt og reducere opløsningen af den endelige tomogram efter genopbygningen.
For det tredje vil scannerindstillingerne for anskaffelse af projektionsbilleder også variere fra instrument til instrument. For at maksimere scannerens opløsningsevne skal X-ray beam spot size være så lille som muligt (5-10 μm). Dette kan opnås ved at afbalancere røntgenspænding og strømindstillinger, således at den samlede effekt er 3-4 W. Med disse indstillinger og den passende eksponeringstid på kameraet kan der opnås korrekt røntgenstråledæmpning af prøven og optimal billedkontrast. Brugen af aluminiums- eller kobberfiltre mellem objektet og røntgenkilden kan bruges til at finjustere de optimale røntgenenergiindstillinger for den bedste billedkontrast eller dæmpe strålen tilstrækkeligt til, at højere drevne kilder kan bruges. Med hensyn til billedopløsning vil dette afhænge af mange forskellige variabler, herunder plettype, antal projektionbilleder, billedpixelstørrelse, kameraposition, prøvebevægelse, scannervibrationer og rekonstruktionsparametre. En bar mønster fantom (QRM GmbH), der indeholder kendte størrelse markører kan hjælpe med at evaluere rumlig opløsning for en given scanner og kamera indstilling.
Det er også værd at vurdere fordelene ved billeddannelse kritisk punkt tørrede eller hydrerede prøver. Sombke et al. foretog en sammenlignende vurdering af de to metoder og fandt, at kritisk punkttørring var overlegen i μ CT-applikationer, der involverede leddyr30. Fordelene ved hydrerede prøver er imidlertid, at dyr udsættes for mindre kemisk og mekanisk eksponering, der kan føre til både kvantitative og morfologiske artefakter. Dette har også tendens til at bevare sarte væv bedre end CPD. Hydrerede prøver har imidlertid en meget kortere holdbarhed og bør afbildes senest en måned efter fikseringen, da vævsforringelse og nedsat billedkvalitet bliver indlysende på det tidspunkt. Opløsningen af hydrerede prøver vil også være lidt mindre end en kritisk punkttørret prøve, fordi røntgenstråler også skal trænge gennem både en plastpipetspids og den omgivende væske (vand eller buffer). Kritisk punkt Tørrede prøver kan bevares i meget længere tid, især når de opbevares på Drierite. De kan også placeres direkte i røntgenstrålestien ved blot at lime vingerne eller benene til en insektstift og placere den i scenepatronen, hvilket forenkler monteringsprocessen. Men den omfattende ethanol dehydrering af disse prøver kan føre til væv svind og tab af sarte væv arkitektur, hvilket er grunden til det er vigtigt at udføre en række stigende EtOH koncentrationer for at minimere disse virkninger. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at alle former for kemisk behandling, herunder paraformaldehydfiksering og endda jodfarvning kan forårsage vævssvind58,59. Mens ingen af metoderne vil give målinger af ‘faktisk organstørrelse’ i en levende flue, er morfometriske målinger stadig gyldige, når man sammenligner mutante og vilde dyr, så længe fikserings-, farvnings- og tørretrin udføres ens for begge sæt prøver – helst parallelt.
Afslutningsvis giver μ-CT et nyttigt hele dyr imaging værktøj til Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Mange andre undersøgelser har fremvist kraften i denne teknologi til forståelse af forskellige aspekter af insekt taksonomi, økologi, fysiologi, udvikling og anatomi, der kan hjælpe med at informere fremtidige undersøgelser i fluer1,28,30,31,32,55,56,57 . Kombineret med de genetiske og lette mikroskopiværktøjer, der allerede er meget udbredt i denne organisme, kan μ-CT positionere sig i en eksperimentel rørledning, der giver mulighed for en dybere forståelse mellem genotype og fænotype.
The authors have nothing to disclose.
Intet af dette ville have været muligt uden støtte fra Nasser Rusan. Jeg vil gerne takke H. Doug Morris, Danielle Donahue, og Brenda Klaunberg af NIH Mouse Imaging Facility og Ben Ache af Micro Photonics for uddannelse og nyttig diskussion. Jeg takker også Mansoureh Norouzi Rad fra Zeiss for at scanne maveprøver på Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith og Rachel Ng hjalp også med scanning. Mike Marsh fra Object Research Systems ydede Dragonfly teknisk support. Jeg er også taknemmelig for støtte fra National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) og Start Up Fonde fra University of Wyoming. Jeg takker også de anonyme korrekturlæsere for deres nyttige forslag og kommentarer.
100% Ethanol | For critical point drying | ||
Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
Heat Block | For microfuge tubes | ||
Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |