Ett protokoll presenteras som möjliggör visualisering av intakt Drosophila melanogaster i alla utvecklingsstadier med hjälp av mikrodatortomografi.
Biomedicinska bildverktyg möjliggör undersökning av molekylära mekanismer över rumsliga skalor, från gener till organismer. Drosophila melanogaster, en väl karakteriserad modellorganism, har dragit nytta av användningen av ljus- och elektronmikroskopi för att förstå genfunktionen på cell- och vävnadsnivå. Tillämpningen av bildplattformar som möjliggör förståelse för genfunktionen på nivån för hela den intakta organismen skulle ytterligare förbättra vår kunskap om genetiska mekanismer. Här presenteras en hel djuravbildningsmetod som beskriver de steg som behövs för att visualisera Drosophila i alla utvecklingsstadier med hjälp av mikrodatortomografi (μ-CT). Fördelarna med μ-CT inkluderar kommersiellt tillgänglig instrumentering och minimal praktisk tid för att producera korrekt 3D-information vid mikronnivåupplösning utan behov av vävnadsdissekerings- eller clearingmetoder. I kombination med programvara som påskyndar bildanalys och 3D-rendering kan detaljerad morfometrisk analys av alla vävnads- eller organsystem utföras för att bättre förstå mekanismer för utveckling, fysiologi och anatomi för både beskrivande och hypotestestningsstudier. Genom att använda ett avbildningsarbetsflöde som innehåller användning av elektronmikroskopi, ljusmikroskopi och μ-CT kan en grundlig utvärdering av genfunktionen utföras, vilket ökar nyttan av denna kraftfulla modellorganism.
Bildframställningsmetoder som möjliggör detaljerad undersökning av inre strukturer av ett objekt utan att förstöra dess övergripande 3D-arkitektur har visat sig vara allmänt fördelaktiga för ett antal olika discipliner, inklusive fysik, teknik, materialvetenskap, arkeologi, paleontologi, geologi ochbiologi 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Bland dessa icke-förstörande avbildningsmetoder är röntgenbaserade plattformar särskilt användbara på grund av förmågan hos högenergiröntgenstrålar att tränga in i många olika provtyper och material med minimal spridning jämfört med synliga ljusvågor. Datortomografi (CT), mikrodatortomografi (μ-CT), nanodatortomografi (Nano-CT) och synkrotronmikrotomografi har därför framträtt som den primära tekniken för röntgenbaserad avbildning av prover som sträcker sig från meter till mikron, med millimeter till submikronupplösningskapacitet10,11,12,13,14.
Medan dessa plattformar skiljer sig åt i sin design, röntgengeometri och komponenter för att balansera provstorlek och upplösning, förlitar de sig alla på samma grundläggande princip för bildinspelning: en källa till röntgenstrålar som färdas genom objektet och fångas av en detektor. Differentiell dämpning av röntgenstrålen när den passerar genom olika densiteter i objektet genererar bildkontrast. 3D-data erhålls genom att antingen provet eller detektorn roteras och en serie 2D-projektionsbilder samlas in som sedan rekonstrueras med hjälp av algoritmer till tomogram som innehåller 3D-information vars upplösning är isotropisk i x,y,z15. För många bänkskivor μ-CT-skannrar som använder en konstråleröntgengeometri för att projicera röntgenstrålar vid objektet som avbildas används Feldkamp-algoritmen för att exakt rekonstruera objektet med minimala fel16.
Upplösningen på en viss plattform bestäms främst av systemparametrar som storleken på röntgenstrålen (dekorstorlek), skannergeometri (avstånd från objekt till röntgenkälla), pixelstorleken på detektorn och den rekonstruktionsalgoritm som används. Ytterligare faktorer, såsom skannervibrationer, röntgenstrålningsfluktuationer, provrörelser och materialtyp eller kemisk fläck som används för att visualisera objektet, kan också avsevärt påverka rumslig upplösning under verkliga avbildningsförberutningar15.
För biomedicinska tillämpningar har CT och μ-CT spelat en nyckelroll för att främja vår förståelse av anatomi, fysiologi, utveckling och sjukdomsmekanismer, som fungerar som ett verktyg för både mänskliga patientdiagnoser och som en preklinisk bildplattform för modellorganismer17,18. Till exempel använder Mouse International Phenotyping Consortium, vars mål är att identifiera funktionen hos varje gen i musgenomet, μ-CT som en del av deras fenotypningspipeline19. Deras resultat har varit avgörande för att förstå gener som är involverade i utvecklings- och sjukdomsprocesser, samtidigt som de fungerar som en atlas för musanatomi och utveckling20. Andra modellorganismer, såsom zebrafisk och råttor, har också helt omfamnat användningen av μ-CT för att utföra heldjurs fenotypning av ett antal genmutanter17,21,22,23.
Fördelen med att kombinera heldjursavbildning med modellorganismer är att en mekanistisk förståelse av genfunktionen för en given biologisk process kan utforskas fullt ut. Detta är möjligt på grund av de väl karakteriserade genomen och många genetiska verktyg som finns tillgängliga i modellorganismer som möjliggör exakt manipulering av genfunktionen vid distinkta utvecklingsmässiga tidspunkter, specifika vävnader, enskilda celler och till och med subcellulära organeller. Dessa inkluderar binära uttryckssystem som UAS / GAL4-systemet (och dess många derivat), CRISPR / Cas9 och RNAi24,25,26. När dessa genetiska verktyg används tillsammans med en kraftfull bildbehandlingspipeline bestående av elektronmikroskopi, ljusmikroskopi (fluorescerande och icke-fluorescerande) och hel djuravbildning som μ-CT, kan en grundlig utvärdering av molekyler, celler, vävnader, organ och hela organismen uppnås, vilket möjliggör en mycket djupare förståelse för genfunktionen.
Detta protokoll fokuserar på användningen av μ-CT i den icke-däggdjursmodellorganism Drosophila melanogaster, vars otaliga genetiska verktyg har hjälpt till att belysa många molekyläramekanismer 26,27. Det antogs från tidigare protokoll i icke-modell insekter1,28,29,30,31,32, och bygger av tidigare μ-CT studier i Drosophila för att upprätta ett standardiserat protokoll för dess användning i detta djur33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Stegen för lyckad provberedning, bildbehandling och analys av μ-CT-datamängder med kommersiellt tillgängliga skannrar beskrivs. Med detta protokoll kan alla utvecklingsstadier i flugan visualiseras med hög upplösning för både beskrivande och hypotestestande studier, inklusive taxonomi, anatomi, utveckling, fysiologi och sjukdom27. Detta protokoll kommer också att vara användbart för avbildning av praktiskt taget alla insekter och till och med icke-levande material som kräver kemisk färgning för bildkontrast för att förbättra visualiseringen μ-CT.
Visualisering intakt Drosophila melanogaster i alla utvecklingsstadier har förblivit en utmaning, främst på grund av inkompatibiliteten hos ljusmikroskopi med den tjocka, pigmenterade nagelband som finns i detta djur. Medan andra hela djurtomografimetoder, såsom Magnetic Resonance Imaging (MRI), Optical Coherence Tomography (OCT) och ultramikroskopi i kombination med vävnadsrensning har använts med framgång iflugor 50,51,52,53,54, μ-CT presenterar ett antal fördelar som gör det idealiskt för hela djuravbildning av denna organism13,15,30 . Röntgenstrålar tränger lätt in i den pigmenterade nagelbanden och deras lilla våglängd möjliggör submikronavbildning. Märkning kräver minimala investeringar i allmänt tillgängliga kemikalier och inga specialiserade bänkfärdigheter13. μ-CT-skannrar är också kommersiellt tillgängliga, och kostnaderna är jämförbara med lätta mikroskopiplattformar, samtidigt som de är mer attraktiva för ett bredare spektrum av discipliner (geologi, paleontologi, teknik etc.) som också kan dra nytta av dess tillgänglighet vid en institution. Synkrotronröntgenkällor kan också användas för högupplöst μ-CT-avbildning av fasta och levande insekter31,55,56, men är mindre tillgängliga än kommersiella bänkskannrar.
Detta protokoll ger ett effektivt sätt att μ av flyg-vuxna, poppa, larva och cellulära embryon. Observera att för många av stegen som beskrivs ovan kan alternativa metoder också tillämpas för att förbereda prover för avbildning. Andra studier har gett en detaljerad jämförelse av olika fixerings-, märknings- och torksteg för användning i insekter och de som är intresserade av att anta denna teknik uppmuntras att utvärdera fördelarna med varjetillvägagångssätt 1,4,13,29,30,57. Även om detta protokoll är relativt enkelt, presenteras några användbara förslag.
För det första bör försiktighet vidtas när nagelband av intakta exemplar störs så att underliggande mjuka vävnader inte störs avsevärt. Det är viktigt att låta larv och tidiga pupalsteg genomgå fixering i 2 timmar i Bouins lösning innan du petar. Detta kommer att stelna vävnaden och begränsa mängden hemolymf som kommer att ooze ut ur nagelbandshålen, vilket kan förändra organarkitekturen. Enskilda kroppssegment (huvud, bröstkorg och buk) hos den vuxna kan separeras om strukturen eller strukturerna av intresse finns där. Det rekommenderas att använda en skalpell för att rent skära igenom dessa segment snarare än att dra isär dem med tång, vilket kan störa tarmens eller centrala nervsystemets 3D-arkitektur, till exempel. När det gäller timing behöver vuxna i allmänhet bara 16 timmar. för fullständig fixering, medan larv- och pupalsteg behöver 24 timmar. Om jod- eller PTA-färgning verkar ojämn kan provet också placeras tillbaka i lösning för att inkubera längre tills jämn färgning uppnås. Slutligen bör hydratiserade prover inte placeras vid 4 °C, eftersom detta verkar inducera bildandet av luftbubblor i kroppshålan efter uppvärmning till rumstemperatur.
För det andra varierar provmonteringen beroende på instrument, scentyp och om provet behöver förbli hydratiserat eller har torkats. Om det är hydratiserat, se till att provet inte läcker och eventuellt förstör skannern. När du monterar provet inuti en pipettspets, var noga med att trycka försiktigt med ett dämpat föremål tills proverna stöter på lite motstånd och inte kan röra sig. Att trycka för hårt kan leda till nagelbandsdeformation och underliggande strukturella defekter. Se också till att provet är justerat i hållaren så nära rotationsaxeln som möjligt. Eventuell wobble kommer att öka skanningstiderna på grund av det större synfältet och minska upplösningen av det slutliga tomogrammet efter återuppbyggnaden.
För det tredje varierar skannerinställningarna för att hämta projektionsbilder också beroende på instrument. För att maximera skannerns upplösningskapacitet bör röntgenstrålens dekorstorlek vara så liten som möjligt (5-10 μm). Detta kan uppnås genom att balansera röntgenspänning och ströminställningar så att den totala strömmen är 3-4 W. Med dessa inställningar och lämplig exponeringstid på kameran kan korrekt röntgenstråledämpning av provet och optimal bildkontrast uppnås. Användningen av aluminium- eller kopparfilter mellan objektet och röntgenkällan kan användas för att finjustera de optimala röntgenenergiinställningarna för bästa bildkontrast eller dämpa strålen tillräckligt för att högre drivna källor ska kunna användas. När det gäller bildupplösning beror detta på många olika variabler, inklusive fläcktyp, antal projektionsbilder, bildpixelstorlek, kameraposition, provrörelse, skannervibrationer och rekonstruktionsparametrar. En stapelmönsterfantom (QRM GmbH) som innehåller markörer för kända storlekar kan hjälpa till att utvärdera rumslig upplösning för en viss skanner och kamerainställning.
Det är också värt att utvärdera fördelarna med att avbilda kritiska punkttorkade eller hydratiserade prover. Sombke et al. gjorde en jämförande bedömning av de två metoderna och fann att kritisk punkttorkning var överlägsen för μ-CT-applikationer som omfattade leddjur30. Fördelarna med hydratiserade prover är dock att djur utsätts för mindre kemisk och mekanisk exponering som kan leda till både kvantitativa och morfologiska artefakter. Detta tenderar också att bevara känsliga vävnader bättre än CPD. Hydratiserade prover har dock en mycket kortare hållbarhetstid och bör avbildas senast en månad efter fixering eftersom vävnadsnedbrytning och minskad bildkvalitet blir uppenbar vid den tidpunkten. Upplösningen av hydratiserade prover kommer också att vara något mindre än ett kritiskt punkttorkat prov, eftersom röntgenstrålar också måste tränga igenom både en plastpipettspets och den omgivande vätskan (vatten eller buffert). Kritiska punkttorkade prover kan bevaras under mycket längre tidsperioder, särskilt när de hålls på drierit. De kan också placeras direkt i röntgenstrålens väg genom att helt enkelt limma vingarna eller benen till en insektsstift och placera den i scenchucken, vilket förenklar monteringsprocessen. Den omfattande etanoldehydrering av dessa prover kan dock leda till vävnad krympning och förlust av känsliga vävnad arkitektur, varför det är viktigt att utföra en rad ökande EtOH koncentrationer för att minimera dessa effekter. Det bör dock noteras att alla former av kemisk behandling, inklusive paraformaldehydfixering och till och med jodfärgning kan orsaka vävnadskrympning58,59. Även om ingen av metoderna kommer att ge mätningar av “faktisk organstorlek” i en levande fluga, är morfometriska mätningar fortfarande giltiga när man jämför mutanta och vilda djur så länge fixerings-, färgnings- och torkstegen utförs på samma sätt för båda provuppsättningarna – helst parallellt.
Sammanfattningsvis ger μ-CT ett användbart helt djuravbildningsverktyg för Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Många andra studier har visat kraften i denna teknik för att förstå olika aspekter av insekts taxonomi, ekologi, fysiologi, utveckling och anatomi som kan hjälpa till att informera framtidastudier i flugor 1,28,30,31,32,55,56,57 . I kombination med de genetiska och lätta mikroskopiverktyg som redan används i stor utsträckning i denna organism kan μ-CT positionera sig inom en experimentell pipeline som möjliggör en djupare förståelse mellan genotyp och fenotyp.
The authors have nothing to disclose.
Inget av detta hade varit möjligt utan stöd från Nasser Rusan. Jag vill tacka H. Doug Morris, Danielle Donahue och Brenda Klaunberg från NIH Mouse Imaging Facility och Ben Ache från Micro Photonics för utbildning och hjälpsam diskussion. Jag tackar också Mansoureh Norouzi Rad från Zeiss för att ha skannat bukprover på Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith och Rachel Ng hjälpte också till med skanning. Mike Marsh från Object Research Systems tillhandahöll Dragonfly teknisk support. Jag är också tacksam för stöd från National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) och Start Up Funds från University of Wyoming. Jag tackar också de anonyma granskarna för deras hjälpsamma förslag och kommentarer.
100% Ethanol | For critical point drying | ||
Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
Heat Block | For microfuge tubes | ||
Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |