Her foreslår vi en metode til effektivt at opnå enkelte muskelfibre i de tidlige postnatale udviklingsstadier fra homozygot mutant Lamin Δ8-11 musemodel, en meget alvorlig model for Emery-Dreifuss muskelsvind (EDMD).
Autosomal dominerende Emery-Dreifuss muskelsvind (EDMD) er forårsaget af mutationer i LMNA genet, som koder A-type nukleare lamins, mellemliggende filament proteiner, der opretholder den nukleare kuvert og komponenterne i nukleoplasma. Vi har for nylig rapporteret, at muskelsvældning i EDMD kan tilskrives iboende epigenetiske dysfunktioner, der påvirker muskel (satellit) stamceller regenerativ kapacitet. Isolation og kultur af enkelt myofibers er en af de mest fysiologiske ex-vivo tilgange til at overvåge satellitceller adfærd inden for deres niche, da de forbliver mellem den basale lamina omkring fiber og sarcolemma. Derfor repræsenterer det et uvurderligt eksperimentelt paradigme at studere satellitceller fra en række murine modeller. Her beskriver vi en re-tilpasset metode til at isolere intakt og levedygtige enkelt myofibers fra post-natal hindlimb muskler (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius og Soleus). Efter denne protokol, vi var i stand til at studere satellitceller fra Lamin Δ8-11 -/- mus, en alvorlig EDMD murine model, på kun 19 dage efter fødslen.
Vi beskriver isolationsproceduren, samt de kulturbetingelser for at opnå en god mængde myofibere og deres tilhørende satellit-celler-afledtafkom. Når dyrket i vækst-faktorer rige medium, satellitceller stammer fra vilde type mus aktivere, formere sig, og i sidste ende differentiere eller undergå selvfornyelse. I homozygot Lamin Δ8-11 -/- mutant mus er disse evner alvorligt svækket.
Denne teknik, hvis strengt fulgt, gør det muligt at studere alle processer i forbindelse med myofiber-associerede satellitcelle selv i tidlige post-natal udviklingsstader og i skrøbelige muskler.
Skeletmuskulatur er et differentieret væv med en af de mest udvidede evne til at regenerere efter træning eller traume1. Denne egenskab skyldes hovedsagelig tilstedeværelsen af stamceller, kaldet satellitceller på grund af deres perifere position mellem basal lamina og plasmalemma af myofiber2. Under postnatal udvikling, satellitceller formere sig og gradvist differentiere, hvilket bidrager til skeletmuskulatur vækst. Når i voksenalderen, satellitceller indtaste en reversibel quiescent tilstand, og efter fysiologiske eller patologiske traumer, de aktiverer, formere sig og differentiere for at reparere de beskadigede muskler3. Fejl i satellitcellers evne til korrekt transit gennem disse forskellige regenerative faser og til at gennemgå selvfornyelse har været fast forbundet med muskelsvind , enten under fysiologiskaldring 4,5,6 eller i muskeldegenerative sygdomme, såsom muskeldystrotrohies7,8,9,10.
Der findes to hovedkulturtilgange til at studere satellitceller ex-vivo: primære myogene kulturer fra mononukleerede celler, mekanisk og kemisk adskilt fra hele muskler11,12; eller kultur af isolerede myofibere13,14,15,16,17,,18,19,20. I det første tilfælde indebærer processen med isolation af satellitceller trituration af hele muskler udvundet fra musen, en kemisk fordøjelse, filtrering og fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS)21. Selv om denne procedure er effektiv til at isolere satellitceller fra en række forskellige modeller, indebærer den flere variabler , der udsætter satellitceller for stress og forstyrrer deres fysiologiske niche22,23. Derimod, myofiber isolation indebærer en blidere fordøjelse af muskelvæv med matrix nedbrydende enzymer og en mekanisk makulering, der forårsager reduceret traumer til stamceller20. Denne anden tilgang giver mulighed for en langt mere effektiv hentning af levedygtige satellitceller, der forbliver fysisk knyttet til deres myofiber mellem basal lamina og sarcolemma, således at analysen inden for deres fysiologiske niche19,20.
Mange forskellige protokoller er blevet foreslået i løbet af de seneste år til korrekt og effektivt at isolere enlige myofibere fra skeletmuskulatur. Allerede i 1986 Foreslog Bischoff en protokol om at isolere fibre fra Flexor Digitorum Brevis13 og senere, i 1995, Rosenblatt et al. ændret protokollen for at opnå en mere effektiv adskillelse af myofibers14. Siden da har mange andre forfattere foreslået justerede procedurer på andre muskler, såsom Extensor Digitorum Longus (EDL) og Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, der er længere, selv om mere skrøbelige, muskler14. Isolerede myofibere kan derefter dyrkes både i vedhæftning, for at give mulighed for udvidelse af satellitceller-afledte myoblaster, eller i flydende forhold, op til 96 timer, at følge afkommet stammer fra enkelt satellitceller19 (Figur 1). Variable serumkoncentrationer i kulturmediet anvendes til at udløse aktivering, spredning og/eller differentiering af satellitceller for at undersøge deres evne til at passere korrekt gennem disse forskelligefaser 1.
Vi har for nylig beskrevet den epigenetiske mekanisme bag udmattelse af satellit stamceller pool i musemodellen af EDMD, Lamin Δ8-11 -/- mus7. Da disse mus normalt dør mellem 4-8 ugeraf alder 24,på grund af alvorlige muskeltab, et forsøg blev gjort for at fange de molekylære defekter, der ligger til grund for den tidlige debut af sygdommen ved at fokusere vores analyse på post-natal muskeludvikling. Flydende enkelt myofibers blev isoleret og dyrket af vildtype og Lamin Δ8-11 -/- mutant7 19 dage gamle mus. På dette stadium, muskeldefekter er allerede indlysende, men mus er stadig levedygtige. Men da alle de ovennævnte protokoller for enkelt myofibers ekstraktion blev optimeret til skeletmuskulatur af voksne mus, vi havde brug for at tilpasse dem til vores formål: meget små mus i form af alder og størrelse, og meget skrøbelige myofibers. Således beskriver vi her vores re-tilpasning af protokollen foreslået af Rudnicki laboratorium19 for at opnå et betydeligt antal enkelt levedygtige myofibers fra mus under postnatal udvikling og fra svær dystrofiske muskler, såsom dem, der stammer fra Lamin Δ8-11 -/- mus24. Det endelige mål med denne tilgang er at give en standardiseret procedure for undersøgelse af myofibers-associerede muskel stamceller i enhver anden musemodel, når de tidlige stadier af postnatal udvikling er af interesse, eller i tilfælde af musemodeller, der transporterer en specifik sygdom, der gør myofibere mere modtagelige for mekanisk stress.
Isolering af intakte enkelt myofibere er en vigtig metode inden for myogenese, når hovedformålet er at karakterisere celle-autonome regenerative kapaciteter af muskelstamceller inden for deres niche, i sunde og patologiske forhold. Men når biokemiske eller genomiske undersøgelser er af interesse, kan FACS-isolerede satellitceller være den bedste løsning.
Single myofibers isolation gør det muligt at følge ex-vivo, men i den mest fysiologiske måde, dynamikken i alle de trin, enkelt satellitceller gennemgå under muskel regenerering, der er: aktivering, celledeling (asymmetrisk og symmetrisk), differentiering og vende tilbage til quiescence ved selvfornyelse. Når myofibers dyrkes i flydende forhold, aktiveres og udvides de enkelte satellitceller, der danner en klynge af celler, der alle stammer fra den samme satellitcelle. Immunofluorescensanalyse for sprednings-, differentierings-, aktiverings- eller stængelmarkører er derefter optimal til at kvantificere forholdet mellem cellestadierne.
Det vigtigste skridt i vores protokol for at opnå levedygtige og intakte myofibers kan betragtes som den hurtige, men blide muskel dissektion, ved senen-til-senen isolation, for at undgå muskelskader. Vores råd er kun at bruge skarpe saks og små skarpe pincet og begrænse hele muskel dissektion procedure til ti minutter. Når det er vanskeligt at isolere meget små muskler (dvs. EDL og TA), er det muligt at skære dem sammen og senere opdele dem ved hjælp af fine saks skære langs langsgående plan efter fibrene. Denne strategi vil i sidste ende give mindre intakt myofibers, men levedygtigheden vil ikke blive kompromitteret. Det samme skal udføres på store muskler som Gastrocnemius at lette fordøjelsen. Optimering af fordøjelsestiden, som skal empirisk valideres, og minimal manipulation af isolerede fibre er også to afgørende aspekter for det positive resultat af efterfølgende analyse.
Fordelen ved protokollen rapporteret her er, at det kan anvendes på meget små mus (i alder og dimension), selv når deres muskler er ekstremt skrøbelige. Selv om ikke nævnt ovenfor, er det muligt at følge denne protokol af dissektion til derefter kultur levedygtige myofibers i længere tid ved hjælp af kælder membran-belagtretter 18,19. Det er vigtigt at overveje, at denne situation er helt forskellig fra flydende tilstand, hvor vedhæftning stimuli og nærhed stimuli er fraværende.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andrea Bianchi, det italienske netværk af Laminopathies og medlemmerne af laboratoriet for støtten og alle de konstruktive kommentarer. Vi er taknemmelige for Chiara Cordiglieri for den dyrebare hjælp på konforosset mikroskop. Forfatterne takker Dr. Beatrice Biferali for hendes hjælp til at tage billeder til tal. Det arbejde, der præsenteres her blev støttet af My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, den italienske sundhedsminister n. GR-2013-02355413 og Cariplo 2017-0649 til C.L. C.M. støttes af My First AIRC grant n.18993 og AFM-Telethon n. 22489.
4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
Lab equipment | Manufacturer | ||
Bunsen burner | |||
Confocal microscope | Leica | ||
Diamond pen | bio-optica | ||
Dissection pins | |||
FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
Glass coverslips | Thermofisher | ||
Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
Glass slides | Thermofisher | ||
Micro dissecting scissors | |||
Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
Micropipette tips | Corning | ||
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
Rubber pipette bulbs | VWR | ||
Sharp tweezers | |||
Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
Water bath at 37°C | VWR |