Denne artikkelen beskriver hvordan du utfører en kirurgisk metode for å hemme sår epidermis dannelse under axolotl lem regenerering ved umiddelbart suturering full tykkelse hud over amputasjonsplanet. Denne metoden gjør det mulig for forskere å undersøke såreptermis funksjonelle roller i de tidlige stadiene av lemregenerering.
Klassiske eksperimenter i salamander regenerativ biologi i løpet av forrige århundre har lenge fastslått at sår epidermis er en avgjørende signalstruktur som dannes raskt etter amputasjon og er nødvendig for lemregenerering. Imidlertid har metoder for å studere sin presise funksjon på molekylært nivå de siste tiårene vært begrenset på grunn av en paucity av presise funksjonelle teknikker og genomisk informasjon tilgjengelig i salamandermodellsystemer. Spennende, den nylige mengden sekvenseringsteknologier kombinert med utgivelsen av ulike salamandergenomer og fremveksten av funksjonelle genetiske testmetoder, inkludert CRISPR, gjør det mulig å besøke disse grunnleggende eksperimentene på nytt ved enestående molekylær oppløsning. Her beskriver jeg hvordan du utfører den klassisk utviklede full hudklaff (FSF) kirurgi i voksne axolotler for å hemme sår epidermis formasjon umiddelbart etter amputasjon. Sårepidermis dannes normalt via distal migrasjon av epitelceller i huden proksimalt til amputasjonsplanet for å forsegle såret fra ytre miljø. Operasjonen innebærer umiddelbart suturering full tykkelse hud (som inkluderer både epidermale og dermale lag) over amputasjonsplanet for å hindre epitelcellemigrasjon og kontakt med underliggende skadet mesenchymal vev. Vellykkede operasjoner resulterer i hemming av blastemadannelse og lemregenerering. Ved å kombinere denne kirurgimetoden med moderne nedstrøms molekylære og funksjonelle analyser, kan forskere begynne å avdekke molekylære underlag av sår epidermis funksjon og biologi under lem regenerering.
Siden Lazzaro Spallanzani rapporterte det i 17681, har salamander lemregenerering vært et av de mest studerte naturlige regenerative fenomenet som har begeistret biologer i århundrer. Vellykket lem regenerering hengsler på dannelsen, utvekst og etterfølgende mønster av en undifferentiated cellulær struktur kjent som blastema. Forskere har gjort betydelige fremskritt i å forstå den cellulære sammensetningen av blastema samt hvilke støttende vev og celletyper som er nødvendige for dannelsen2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Likevel forblir de koordinerte signalmekanismene mellom forskjellige vev og celletyper som fører til initiering av blastemadannelse dårlig forstått.
Et sentralt krav for vellykket blastemadannelse og regenerering er sårepidermis, et forbigående og spesialisert epitel som dekker amputasjonsplanet innen 12 timer etter amputasjon10. Etter amputasjon migrerer epitelceller fra den intakte huden proksimalt til skaden raskt over amputasjonsplanet for å danne et tynt sårepitelet14. Etter hvert som blastema dannes i de følgende ukene, utvikler de tidlige sårepidermis seg til en tykkere epitelsignalstruktur kalt den apikale epitelhetten (AEC)15. Mens normal hud med full tykkelse inneholder både et epitel- og dermalt lag atskilt med en basal lamina, består sårepidermis/AEC bare av et epitellag og mangler en basal lamina16,17. Fraværet av basal lamina og dermis gir direkte kontakt mellom sårepitelcellene og det underliggende vevet, noe som letter toveis signalering mellom de to rommene som er kritiske for både blastemadannelse og vedlikehold17,18.
Klassiske eksperimentelle studier utviklet ulike innovative kirurgiske metoder for å sondere sår epidermis / AEC-funksjon og nødvendighet ved å hemme dannelsen. Disse metodene inkluderte suturing19 eller podning full tykkelse hud20,21 over amputasjonsplanet, umiddelbart suturere amputert lem inn i kroppshulen22, og kontinuerlig daglig fjerning eller bestråling av tidlig sår epidermis og AEC23,24. Til sammen etablerte disse eksperimentene ikke bare betydningen av sårepæren / AEC, men bestemte også ytterligere sine roller i tidlig vevs histolyse, samt opprettholde stamcelleproliferasjon og blastemal utvekst13 gjennom regenerering.
Imidlertid var disse tidligere studiene i stor grad begrenset til histologisk farging samt tritierte tymidinpulser for å spore celleproliferasjon. Faktisk har det bare nylig blitt gjort å revidere disse klassiske eksperimentene med moderne sekvenseringsteknologier og funksjonelle teknikker i salamandere, og har ført til oppdagelsen av ytterligere roller for sårepermis i modulering av betennelse og ECM-nedbrytning / avsetning i tidlige stadier av regenerering25. Med utgivelsen av ulike salamandergenom- og transkripsjonssekvenser26,27,28,29,30,31,32,33,34, samt det voksende antallet funksjonelle metoder tilgjengelig i salamanderarter11,35,36,37,38 , forskere er nå godt posisjonert til å begynne å avdekke molekylære mekanismer som driver sår epidermis dannelse, funksjon og AEC utvikling.
Dessverre er flere av disse klassiske metodene som brukes til å hemme sår epidermisdannelse teknisk utfordrende, og presenterer vanskeligheter for reproduserbarhet mellom biologiske repliker i samme eksperiment. For eksempel kan det være utfordrende å opprettholde hudtransplantasjoner, da grafts til slutt kan falle av vertslemmen og fjerning av såreplemmen / AEC daglig er vanskelig uten å skade det underliggende vevet. Videre er det utfordrende å suturere amputert lem i kroppshulen og krever også ytterligere skade på innsettingsstedet. På den annen side er suturering full tykkelse hud umiddelbart over amputasjonsplanet relativt enkelt, teknisk reproduserbart, og introduserer minimal vevsskade. Denne fulle hudklaffen (FSF) kirurgisk metode ble tidligere utviklet av Anthony Mescher i 1976 i voksne newts (Notophthalmus viridiscens). Han viste at FSF-operasjonen hemmet sårepidermisdannelse og funksjon ved å forby både epitelcellemigrasjon over amputasjonsplanet og direkte kontakt mellom epitelceller og underliggende vev.
Her vises denne kirurgiske prosedyren trinn for trinn ved hjelp av axolotllemmen. Kombinert med moderne molekylære og sekvenserende teknologier, kan denne teknikken vise seg å være svært nyttig for forskere å utdype vår forståelse av sår epidermis / AEC formasjon og funksjon under lem regenerering.
Denne artikkelen beskriver en protokoll for å utføre fulle hudklaffoperasjoner i axolotl lemmer for å hemme sår epidermis dannelse. Mens denne operasjonen er relativt enkel og teknisk reproduserbar sammenlignet med andre metoder for hemming av sår epidermis dannelse, er det flere kritiske trinn som kan påvirke suksessen til operasjonen. For det første, når du trekker den intakte fulle hudklaffen over det eksponerte underliggende vevet, er det viktig at hele tykkelseshuden ikke blir skadet på noen måte. Skader på hudklaffen kan fortsatt føre til dannelse av en liten sår epidermis, noe som kan resultere i en liten blastema-lignende utvekst. For det andre, sørg for at suturer ikke faller ut under postoperativ omsorg, da dette også kan føre til dannelse av en liten sår epidermis. Til dette punktet er det viktig å minimere den potensielle kontakten mellom den suturerte lemmen og eventuelle overflater, spesielt i løpet av den første uken etter operasjonen. Flere måter å forhindre dette innebærer boliger og bedøvelse av axolotl i en stor nok beholder slik at axolotl har god plass til å bevege seg rundt etter operasjonen.
Denne operasjonen har også flere begrensninger. Kanskje den mest bemerkelsesverdige er at suksessen til operasjoner bare kan vurderes på to måter: ved å bruke dissekeringsområdet i løpet av de to første ukene av operasjonen for å søke etter fravær av sårepær og / eller sjekke om en blastema dannes innen 3 uker. Selv om disse metodene er effektive, er de relativt lave gjennomstrømning. Utviklingen av fremtidige transgene reporter-axolotler for sår epidermis-spesifikke markører kan hjelpe til med raskere screening for vellykkede versus mislykkede operasjoner. Videre er denne operasjonen vanskeligere å utføre på yngre dyr, da den intakte huden er mer skjøre. Bruk av sub-voksen eller voksen axolotls anbefales dermed.
Mens denne operasjonen opprinnelig ble utviklet i N. viridiscens19, har den lett blitt tilpasset for axolotls25,39 og kan sannsynligvis brukes på andre salamanderarter også. I sum vil bruk av denne teknikken på fremtidige lemregenereringsstudier gi forskere mulighet til både å utvikle flere verktøy for å adressere sår epidermisbiologi og identifisere de underliggende mekanismene som driver funksjonen i å initiere blastemadannelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren takker Doug for hans konstante oppmuntring og urokkelige støtte, samt medlemmene av Melton-laboratoriet for deres nyttige tilbakemeldinger og kommentarer til manuskriptet. Forfatteren vil også takke Harvard Office of Animal Resources (OAR) for deres dedikerte dyrepleie.
Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |