Denna artikel beskriver hur man utför en kirurgisk metod för att hämma sår epidermis bildas under axolotl lem regenerering genom att omedelbart suturera full tjocklek huden över amputation planet. Denna metod gör det möjligt för forskare att undersöka de funktionella rollerna för såret epidermis under de tidiga stadierna av lem regenerering.
Klassiska experiment i salamander regenerativ biologi under det senaste århundradet har länge fastställt att såret epidermis är en avgörande signalstruktur som bildas snabbt efter amputation och krävs för lem regenerering. Metoder för att studera dess exakta funktion på molekylär nivå under de senaste decennierna har dock begränsats på grund av en brist på exakta funktionella tekniker och genomisk information som finns tillgänglig i salamandermodellsystem. Spännande, den senaste tidens mängd sekvenseringsteknik i kombination med frisättningen av olika salamandergenom och tillkomsten av funktionella genetiska testmetoder, inklusive CRISPR, gör det möjligt att återbesöka dessa grundläggande experiment med oöverträffad molekylär upplösning. Här beskriver jag hur man utför den klassiskt utvecklade full hud lock (FSF) kirurgi i vuxna axolotls för att hämma sår epidermis bildas omedelbart efter amputation. Såret epidermis bildas normalt via distala migration av epitelceller i huden proximalt till amputation planet för att försegla såret från den yttre miljön. Kirurgi innebär omedelbart suturering full tjocklek huden (som inkluderar både epidermal och dermal lager) över amputation planet för att hindra epitelial cell migration och kontakt med underliggande skadade mesenchymal vävnader. Framgångsrika operationer resulterar i hämning av blastema bildandet och lem regenerering. Genom att kombinera denna kirurgimetod med samtida nedströms molekylära och funktionella analyser kan forskare börja upptäcka molekylära understöd av sår epidermis funktion och biologi under lem regenerering.
Sedan Lazzaro Spallanzani rapporterade det 17681 har salamander lem regenerering varit en av de mest väl studerade naturliga regenerativa fenomen som har enamored biologer i århundraden. Framgångsrika lem regenerering beror på bildandet, utväxt och efterföljande mönstring av en odifferentierad cellulär struktur som kallas blastema. Forskare har gjort betydande framsteg i förståelsen av blastemas cellulära sammansättning samt vilka stödjande vävnader och celltyper som är nödvändiga för dess bildande2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Ändå är de samordnade signalmekanismerna mellan olika vävnader och celltyper som leder till initiering av blastemabildning fortfarande dåligt förstådda.
Ett viktigt krav för framgångsrik blastema bildandet och regenerering är såret epidermis, en transient och specialiserad epitel som täcker amputation planet inom 12 timmar efter amputation10. Efter amputation migrerar epitelceller från intakt hud proximal till skadan snabbt över amputationsplanet för att bilda ett tunt sår epitelium14. Som blastema bildas under de följande veckorna, utvecklas det tidiga sår epidermis till en tjockare epitelial signalering struktur kallas den apikala epitelial cap (AEC)15. Medan normal full tjocklek hud innehåller både ett epitelial och dermal lager åtskilda av en basal lamina, såret epidermis/AEC består endast av ett epitelial lager och saknar en basal lamina16,17. Frånvaron av basal lamina och dermis möjliggör direkt kontakt mellan sår epitelcellerna och de underliggande vävnaderna, vilket underlättar dubbelriktad signalering mellan de två facken som är avgörande för både blastemabildning och underhåll17,18.
Klassiska experimentella studier utformade olika innovativa kirurgiska metoder för att undersöka sår epidermis/AEC funktion och nödvändighet genom att hämma dess bildandet. Dessa metoder inkluderade suturering19 eller ympning av full tjocklek huden20,21 över amputation planet, omedelbart suturing den amputerade delen i kroppen hålighet22 och kontinuerlig daglig borttagning eller bestrålning av det tidiga såret epidermis och AEC23,24. Sammantaget etablerade dessa experiment inte bara betydelsen av såret epidermis/AEC, men också ytterligare fastställt dess roller i tidig vävnad histolys samt upprätthålla stamceller spridning och blastemal utväxt13 under hela regenerering.
Dessa tidigare studier var dock till stor del begränsade till histologiska färgning samt tritiated tymidin pulser för att spåra cell spridning. Faktum är att återbesöka dessa klassiska experiment med modern sekvenseringsteknik och funktionella tekniker i salamandrar har nyligen gjorts och har lett till upptäckten av ytterligare roller för sår epidermis i modulering inflammation och ECM nedbrytning /deposition under tidiga stadier av regenerering25. Med frigöraren av olika salamandergenom och transkriptomsekvenser26,27,28,29,30,31,32,33,34, liksom det spirande antalet funktionella metoder som finns tillgängliga hos salamanderarter11,35,36,37,38 är forskare nu väl positionerade för att börja nysta upp de molekylära mekanismer som driver sår epidermisbildning, funktion och AEC-utveckling.
Tyvärr är flera av dessa klassiska metoder som används för att hämma sår epidermis bildas tekniskt utmanande, vilket ger svårigheter för reproducerbarhet mellan biologiska replikat i samma experiment. Till exempel, upprätthålla huden ympkvistar kan vara utmanande som ympkvistar kan så småningom falla av värd lem och avlägsnande av såret epidermis/AEC dagligen är svårt utan att skada de underliggande vävnaderna. Dessutom är det utmanande att sutsäkra den amputerade delen i kroppshålan och kräver också ytterligare skada på insättningsplatsen. Å andra sidan är suturering av full tjocklek hud omedelbart över amputationsplanet relativt enkelt, tekniskt reproducerbart och introducerar minimal vävnadsskada. Denna full huden lock (FSF) kirurgiska metod utvecklades tidigare av Anthony Mescher 1976 i vuxna newts (Notophthalmus viridiscens). Han visade att FSF kirurgi hämmade sår epidermis bildas och funktion genom att förbjuda både epitelial cell migration över amputation plan och direkt kontakt mellan epitelial celler och de underliggande vävnaderna.
Här visas detta kirurgiska ingrepp steg för steg med hjälp av axolotl lem. Tillsammans med moderna molekylära och sekvensering teknik, denna teknik kan visa sig vara till stor hjälp för forskare att fördjupa vår förståelse av sår epidermis/AEC bildandet och funktion under lem regenerering.
Denna artikel beskriver ett protokoll för att utföra full huden lock operationer i axolotl lemmar att hämma sår epidermis bildas. Medan denna kirurgi är relativt enkel och tekniskt reproducerbar jämfört med andra metoder för att hämma sår epidermis bildas, det finns flera kritiska steg som kan påverka framgången för operationen. För det första, när man drar den intakta fulla hudklaffen över de exponerade underliggande vävnaderna, är det av största vikt att hela tjocklekshuden inte skadas på något sätt. Skador på hudklaffen kan fortfarande leda till bildandet av ett litet sår epidermis, vilket kan resultera i en liten blastema-liknande utväxt. För det andra, se till att suturer inte faller ut under postoperativ vård eftersom detta också kan leda till bildandet av ett litet sår epidermis. Till denna punkt är det viktigt att minimera den potentiella kontakten mellan den suturerade delen och eventuella ytor, särskilt under den första veckan efter operationen. Flera sätt att förhindra detta innebär att man inhyser och bedövar axolotl i en tillräckligt stor behållare så att axolotl har gott om utrymme att röra sig efter operationen.
Denna operation har också flera begränsningar. Kanske det mest anmärkningsvärda är att framgången för operationer endast kan bedömas på två sätt: använda dissekeringsområdet under de första två veckorna av operationen för att söka efter frånvaro av ett sår epidermis och / eller kontrollera om en blastema bildas inom 3 veckor. Även om dessa metoder är effektiva är de relativt låga data flöde. Utvecklingen av framtida transgenic reporter axolotls för sår epidermis-specifika markörer kan bidra till snabbare screening för framgångsrika kontra misslyckade operationer. Dessutom är denna operation svårare att utföra på yngre djur eftersom den intakta huden är mer ömtålig. Användning av axolotls för vuxna eller vuxna rekommenderas därför.
Medan denna kirurgi ursprungligen utvecklades i N. viridiscens19, har den lätt anpassats för axolotls25,39 och kan sannolikt tillämpas på andra salamanderarter samt. Sammanfattningsvis, tillämpa denna teknik på framtida lem regenerativa studier kommer att ge forskare möjlighet att både utveckla fler verktyg för att ta itu med sår epidermis biologi och identifiera de underliggande mekanismerna som driver dess funktion i att initiera blastema bildas.
The authors have nothing to disclose.
Författaren tackar Doug för hans ständiga uppmuntran och orubbliga stöd, liksom medlemmarna i Melton-labbet för deras hjälpsamma feedback och kommentarer om manuskriptet. Författaren vill också tacka Harvard Office of Animal Resources (OAR) för deras dedikerade djurvård.
Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |