Detta protokoll presenterar en metod för fingeravtryck och utforska flerdimensionella data som samlats in av omfattande tvådimensionell gaskromatografi i kombination med masspektrometri. Dedikerade mönsterigenkänningsalgoritmer (mallmatchning) tillämpas för att utforska den kemiska information som krypterats i den flyktiga fraktionen för extra jungfruolja (dvs. volatilome).
Databehandling och utvärdering är kritiska steg för omfattande tvådimensionell gaskromatografi (GCxGC), särskilt när de är kopplade till masspektrometri. Den omfattande informationen som krypteras i data kan vara mycket värdefull men svår att komma åt effektivt. Datadensitet och komplexitet kan leda till långa utarbetandetider och kräva mödosamma, analytikerberoende procedurer. Effektiva men tillgängliga databehandlingsverktyg är därför avgörande för att möjliggöra spridning och acceptans av denna avancerade flerdimensionella teknik i laboratorier för daglig användning. Data analys protokollet som presenteras i detta arbete använder kromatografisk fingeravtryck och mall matchning för att uppnå målet om högautomatisk dekonstruktion av komplexa tvådimensionella kromatogram i enskilda kemiska funktioner för avancerad erkännande av informativa mönster inom enskilda kromatogram och över uppsättningar av kromatogram. Protokollet ger hög konsekvens och tillförlitlighet med liten intervention. Samtidigt är analytikertillsyn möjlig i en mängd olika inställningar och begränsningsfunktioner som kan anpassas för att ge flexibilitet och kapacitet att anpassa sig till olika behov och mål. Mallmatchning visas här vara ett kraftfullt tillvägagångssätt för att utforska extra jungfruolja volatilome. Korsjustering av toppar utförs inte bara för kända mål, men också för omålade föreningar, vilket avsevärt ökar karakteriseringskraften för ett brett spektrum av applikationer. Exempel presenteras för att bevisa prestandan för klassificering och jämförelse av kromatografiska mönster från provuppsättningar som analyseras under liknande förhållanden.
Omfattande tvådimensionell gaskromatografi i kombination med tiden för flygningen massa spektrometrisk detektion (GC×GC-TOF MS) är idag den mest informativa analytiska metoden för kemisk karakterisering av komplexa prover1,2,3,4,5. I GC×GC ansluts och samverkas kolumnerna seriellt med en modulator (t.ex. ett termiskt eller ventilbaserat fokuseringsgränssnitt) som fångar upp eluterande komponenter från den första dimensionen(1D) innan de återinjektes till den andra dimensionen(2D) kolumnen. Denna operation görs inom en fast moduleringstid (PM), i allmänhet mellan 0,5-8 s. Genom termisk modulering inkluderar processen kryofångst och fokusering av elutingbandet med vissa fördelar för den totala separationskraften.
Även om GC×GC är en tvådimensionell separationsteknik, producerar processen sekventiella datavärden. Detektorn analog-till-digital (A/D) omvandlare erhåller kromatografisk signalutgång vid en viss frekvens. Sedan lagras data i specifika proprietära format som inte bara innehåller digitaliserade data utan även relaterade metadata (information om data). A/D-omvandlaren som används i GC×GC-system hjälper till att kartlägga intensiteten hos den kromatografiska signalen till ett digitalt tal (DN) som en funktion av tiden i de två analytiska dimensionerna. Enkanalsdetektorer (t.ex. flamjoniseringsdetektor (FID), elektronavskiljningsdetektor (ECD), svavel chemiluminescensdetektor (SCD), etc.) ger enstaka värden per provtagningstid, medan flerkanalsdetektorer (t.ex. masspektrometrisk detektor (MS)) ger flera värden (vanligtvis över ett spektralområde) per provtagningstid längs den analytiska körningen.
För att visualisera 2D-data börjar utarbetandet med rastrering av ett enda datavärden för moduleringsperioden (eller cykeln) som en kolumn med pixlar (bildelement som motsvarar detektorhändelser). Längs ordinaten (Y-axeln, nedifrån och upp) visualiseras 2D-separationstiden. Pixelkolumner bearbetas sekventiellt så att abscissa (X-axel, vänster till höger) rapporterar 1D separationstid. Den här ordningen presenterar 2D-datai ett högerhänt kartesiskt koordinatsystem, med 1D kvarhållningsordningen som det första indexet i matrisen.
Databehandling av 2D-kromatogram ger tillgång till en högre informationsnivå än rådata, vilket möjliggör 2D toppdetektering, toppidentifiering, extraktion av svarsdata för kvantitativ analys och jämförande analys.
Toppmönstren på 2D kan behandlas som provets unika fingeravtryck och detekteras som minutiae-funktioner för effektiv korskonparativ analys. Detta tillvägagångssätt, känt som mallbaserad fingeravtryck6,7,inspirerades av biometriska fingeravtryck6. Automatiska biometriska fingeravtrycksverifieringssystem förlitar sig i själva verket på unika fingertoppsegenskaper: åsbifurcations och ändelse, lokaliserade och extraherade från bläckade intryck eller detaljerade bilder. Dessa egenskaper, med namnet minutiae-funktioner, matchas sedan med tillgängliga lagrademallar 8,9.
Som nämnts ovan består varje GC×GC-separationsmönster av 2D-toppar rationellt fördelade över ett tvådimensionellt plan. Varje topp motsvarar en enda analyt, har sin informativa potential och kan behandlas som en enda funktion för jämförande mönsteranalys.
Här presenterar vi ett effektivt tillvägagångssätt för kemisk fingeravtryck av GC×GC-TOF MS med tandemjonisering. Målet är att helt och kvantitativt katalogisera funktioner från en uppsättning kromatogram.
Jämfört med befintlig kommersiell programvara eller interna rutiner10,11 som använder en toppfunktioner strategi, mall-baserade fingeravtryck kännetecknas av hög specificitet, effektivitet och begränsad beräkningstid. Dessutom har den en inneboende flexibilitet som möjliggör korsjustering av minutiafunktioner (dvs. 2D-toppar) mellan allvarligt felriktade kromatogram som de som förvärvats genom olika instrumentering eller i långtidsstudier12,13,14.
Den föreslagna metodens grundläggande åtgärder beskrivs kortfattat för att vägleda läsaren till en god förståelse av 2 D-mönstretskomplexitet och informationskraft. Sedan, genom att utforska instrumentets utmatningsdatamatris, utförs kemisk identifiering och kända riktade analyter som ligger över det tvådimensionella utrymmet. Mallen med riktade toppar byggs sedan och tillämpas på en serie kromatogram som förvärvats inom samma analysparti. Metadata relaterade till kvarhållningstider, spektralsignaturer och svar (absoluta och relativa) extraheras från omjusterade mönster av riktade toppar och används för att avslöja kompositionsskillnader i provuppsättningen.
Som ett ytterligare, unikt steg i processen utförs också en kombinerad obefläckad och riktad (UT) fingeravtryck på förriktade kromatogram för att utöka fingeravtryckspotentialen till både kända och okända analyter. Processen producerar en UT-mall för en verkligt omfattande jämförande analys som till stor del kan automatiseras.
Som ett sista steg utför metoden korsjustering av funktioner i två parallelldetektorsignaler som produceras med hög och låg elektronjoniseringsenergi (70 och 12 eV).
Protokollet är ganska flexibelt när det gäller att stödja analyser av ett enda kromatogram eller en uppsättning kromatogram och med variabel kromatografi och/eller flera detektorer. Här demonstreras protokollet med en kommersiellt tillgänglig GC×GC Software suite (se Table of materials)kombinerat med ett MS-bibliotek och sökprogramvara (se Materialförteckning). Några av de nödvändiga verktygen finns i annan programvara och liknande verktyg kan implementeras oberoende av beskrivningar i litteraturen av Reichenbach och medarbetare15,16,17,18,19. Rådata för demonstrationen kommer från en forskningsstudie om olja som inte är jungfruolja (EVO) och som utförts i författarnas laboratorium14. I synnerhet provtas den flyktiga fraktionen (dvs. volatilome) av italienska EVO-oljor genom mikroextraktion i huvudutrymmet (HS-SPME) och analyseras av GC×GC-TOF MS för att fånga diagnostiska fingeravtryck för kvalitet och sensorisk kvalificering av prover. Närmare uppgifter om prover, provtagningsförhållanden och analytiska uppsättningar finns i materialförteckningen.
Steg 1–6 beskriver förbearbetning av kromatogrammen. Steg 7–9 beskriver bearbetning och analys av enskilda kromatogram. Steg 10–12 beskriver mallskapande och matchning, som ligger till grund för korsprovsanalys. Steg 13–16 beskriver hur protokollet tillämpas på en uppsättning kromatogram, med steg 14–16 för UT-analys.
Visualisering av GC×GC-TOF MS-data är ett grundläggande steg för en lämplig förståelse av de resultat som uppnås genom omfattande tvådimensionella separationer. Bilddiagram med anpassad färgläggning gör det möjligt för analytiker att uppskatta detektorresponsskillnader och därmed differentierad fördelning av provkomponenter. Detta visuella tillvägagångssätt förändrar helt analytikernas perspektiv på tolkning och utarbetande av kromatogram. Detta första steg, som en gång förstods och självsäkert användes av kromatografer, öppnar ett nytt perspektiv vid vidare bearbetning.
En annan grundläggande aspekt av databehandlingen är tillgängligheten till den fullständiga datamatrisen (dvs. MS-spektraldata och svar) för alla exempelpunkter, som var och en motsvarar en enda detektorhändelse. I detta avseende toppar 2D integrationen, så att insamlingen av detektorhändelser som motsvarar en enda analyt utgör ett kritiskt steg. I det nuvarande protokollet baseras 2D-toppar på vattendelaralgoritmen18 med vissa anpassningar inkluderade för att förbättra detektionskänsligheten vid partiella samutspädande föreningar. För att göra denna process mer specifik måste decentralisering ske och mer sofistikerade förfaranden antas. Detta är möjligt genom att utföra en jon topp identifiering för MS-data; algoritmen bearbetar datamatrisen och isolerar svaret från enstaka analyter baserat på spektralprofilerna19,31.
Ett viktigt men kritiskt steg i protokollet, och av alla GC×GC-MS-datatolkningsprocess, avser analytesidentifiering. Detta förfarande, som föreslås i steg 8 och 9, i avsaknad av en bekräftande analys med autentiska standarder, måste genomföras noggrant av analytikern. Automatiserade åtgärder är tillgängliga i alla kommersiella program; De omfattar en bedömning av medlemsstaternas spektralsignatur mot det insamlade referensspektrat (dvs. spektralbibliotek) och utvärdering av karakteristiska förhållanden mellan kvalificerings-/kvantifierarejoner. Ytterligare bekräftande kriterier behövs dock för att dölja identifieringen av isomerer. I protokollet föreslås antagandet av linjära bevarandeindex för att prioritera listan över kandidater. Gränsen här gäller tillgången till lagringsdata och dess enhetlighet.
Den viktigaste egenskapen som gör detta tillvägagångssätt unikt ärmallmatchning 12,13,15,29. Mallmatchning möjliggör 2D-mönsterigenkänning på ett mycket effektivt, specifikt och intuitivt sätt. Det kan ställas in, när det gäller känslighet och specificitet, genom att tillämpa anpassade tröskelvärden och/eller begränsningsfunktioner medan analytikern kan övervaka proceduren genom att aktivt interagera med transformeringsfunktionsparametrar. Denna processs särdrag bygger på möjligheten att korsjustera riktad och oriktad toppinformation mellan prover av ett enhetligt parti men också mellan prover som förvärvats med samma nominella förhållanden trots medelhög till allvarlig feljustering. Fördelarna med denna operation gäller möjligheten att bevara alla riktade analyteridentifieringar, vilket är en tidskrävande uppgift för analytikern, och alla metadata som sparats för riktade och oberiktade toppar från tidigare utarbetande sessioner.
Mallmatchning är också mycket effektivt när det gäller beräkningstid; MS-datafiler med låg upplösning består av cirka 1–2 Gb packade data medan högupplösta MS-analyser kan nå 10–15 Gb per enskild analyskörning. Mallmatchning bearbetar inte den fullständiga datamatrisen varje gång, men utför först justering av kvarhållningstid mellan kromatogram med malltoppar då, bearbetar kandidattoppar i sökfönstret för deras likhetsmatchning med referens i mallen. Vid allvarlig feljustering, den mest utmanande situationen, presterade globala andra ordningens polynomtransformer bättre än lokala metoder samtidigt som beräkningstiden13 minskade.
För att GC×GC-tekniken ska spridas brett utanför den akademiska världen och forskningslaboratorier måste databehandlingsverktyg underlätta grundläggande åtgärder för visualisering och kromatograminspektion. Identifiering av analyter bör ge möjlighet att anta standardiserade algoritmer och förfaranden (t.ex. NIST-sökalgoritm och IT-kalibrering). och jämförande analys bör vara intuitiv, effektiv och stödjas av interaktiva verktyg. Den föreslagna metoden tillgodoser dessa behov samtidigt som den erbjuder avancerade alternativ och verktyg för att hantera komplexa situationer som analyter sam-eluering, flera analyter kalibrering, grupp typ analys och parallell identifiering justering.
Den refererade litteraturen täcker väl många möjliga scenarier där GC×GC och, mer allmänt, omfattande tvådimensionell kromatografi, erbjuder unika lösningar och tillförlitliga resultat som inte kan uppnås genom 1D-kromatografi i enkörningsanalys. 5,32,33 Även om GC×GC är det mest kraftfulla verktyget som ökar separationskapaciteten och känsligheten, finns det alltid begränsningar för separationskraft, känslighet och annan systemisk kapacitet. När dessa systemgränser närmar sig blir dataanalysen allt svårare. Därför måste forskning och utveckling fortsätta att förbättra de analysverktyg som står till vårt förfogande.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen stöddes av Progetto Ager − Fondazioni i rete per la ricerca agroalimentare. Projekt akronym Violin – Valorisering av italienska olivprodukter genom innovativa analysverktyg (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). GC Image-programvara är tillgänglig för en gratis provperiod för läsare som vill demonstrera och testa protokollet.
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |