Detectie van microRNA-expressie in de nieren van immunoglobuline A nefropathische muizen
Summary
microRNA’s zijn betrokken bij de pathogenese van IgA-nefropathie. We hebben een betrouwbare methode ontwikkeld voor het detecteren van microRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). Deze nieuwe methode zal het gemakkelijker maken om te controleren op betrokkenheid van miRNA’s bij IgA-nefropathie.
Abstract
Immunoglobuline A (IgA) nefropathie is een type primaire glomerulonefritis dat wordt gekenmerkt door de abnormale afzetting van IgA, wat leidt tot nierfalen in het eindstadium. In de afgelopen jaren is de betrokkenheid van microRNA’s (miRNA’s) gemeld bij de pathogenese van IgA-nefropathie. Er is echter geen gevestigde methode voor het profileren van miRNA’s in IgA-nefropathie met behulp van modellen voor kleine dieren. Daarom hebben we een betrouwbare methode ontwikkeld voor het analyseren van miRNA in de nier van een IgA-muismodel (HIGA-muis). Het doel van dit protocol is om de veranderde expressieniveaus van miRNA’s in de nieren van HIGA-muizen te detecteren in vergelijking met de niveaus in nieren van controlemuizen. In het kort bestaat deze methode uit vier stappen: 1) het verkrijgen van niermonsters van HIGA-muizen; 2) het zuiveren van totaal RNA uit niermonsters; 3) het synthetiseren van complementair DNA uit totaal RNA; en 4) kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) van miRNA’s. Met behulp van deze methode hebben we met succes de expressieniveaus van verschillende miRNA’s (miR-155-5p, miR-146a-5p en miR-21-5p) in de nieren van HIGA-muizen gedetecteerd. Deze nieuwe methode kan worden toegepast op andere studies die miRNA’s profileren bij IgA-nefropathie.
Introduction
Immunoglobuline A (IgA) nefropathie is een type primaire glomerulonefritis dat wordt gekenmerkt door de abnormale afzetting van IgA in het renale glomerulaire mesangiale gebied 1,2. Het is de meest voorkomende van de primaire glomerulonefritis en leidt tot het eindstadium nierfalen bij 20% -40% van de patiënten2. De oorzaak is nog onbekend, maar aanhoudende mucosale infectie is geïmpliceerd 1,3. Corticosteroïden, immunosuppressiva en renine-angiotensinesysteemremmers zijn voorgesteld als therapeutische methoden1,3, maar zijn niet volledig vastgesteld3. Daarom is verder onderzoek nodig om de etiologie en therapeutische methoden voor de behandeling van IgA-nefropathie te verduidelijken.
microRNA’s (miRNA’s) zijn kleine, niet-coderende RNA’s die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van genexpressie 4,5. miRNA’s zijn naar verluidt betrokken bij de pathogenese van verschillende ziekten, en sommige zijn geïdentificeerd als ziektebiomarkers en therapeutische middelen 4,5. In de afgelopen jaren is ook een verband tussen miRNA’s en de pathogenese van IgA-nefropathie gemeld 2,6,7. MiR-148b bleek bijvoorbeeld betrokken te zijn bij structurele afwijkingen van IgA bij patiënten met IgA-nefropathie 2,6,7, terwijl miR-148b en let-7b werden gedocumenteerd als nieuwe biomarkers voor het detecteren van IgA-nefropathie7. Hoewel het begrijpen van de effecten van miRNA’s op IgA-nefropathie kan helpen bij het verder ophelderen van etiologie en behandeling 2, zijn standaardmethoden voor het profileren van miRNA’s in IgA-nefropathie met behulp van kleine diermodellen nog niet vastgesteld2.
Hierin ontwikkelden we een eenvoudige en betrouwbare methode voor het meten van miRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). De HIGA-muis is een karakteristieke ddY-stam met een bijzonder hoog serum-IgA-gehalte en de abnormale afzetting van IgA in nierglomeruli 8,9,10,11. Daarom kunnen HIGA-muizen worden gebruikt als een IgA-nefropathiemuismodel 8,9,10,11. Onze methode bestaat uit vier belangrijke stappen: ten eerste, het operatief verkrijgen van niermonsters van HIGA-muizen; ten tweede, het homogeniseren van monsters en het zuiveren van totaal RNA met behulp van een op silicamembraan gebaseerde spinkolom; ten derde, het synthetiseren van complementair DNA (cDNA) uit totaal RNA met behulp van reverse transcriptie; en ten vierde, het detecteren van de expressieniveaus van miRNA door kwantitatieve reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). De onderbouwing van deze methode en de betrouwbaarheid van de resultaten zijn gebaseerd op eerdere rapporten12,13. We tonen aan dat dit een nuttige techniek is om miRNA-expressieniveaus nauwkeurig te meten in een IgA-nefropathiemuismodel en dat het kan worden gebruikt om toekomstig onderzoek naar miRNA’s in IgA-nefropathie te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
We waren in staat om de expressieniveaus van miRNA’s in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen) te meten met behulp van deze nieuwe methode. IgA-nefropathie is een onverklaarbare ziekte die verder onderzoek nodig heeft om de etiologie en therapeutische doelen te verduidelijken 1,3. Het verkrijgen van menselijke niermonsters is echter zeer invasief. Deze nieuwe techniek is voordelig omdat het de studie van IgA-nefropathie met behulp van kleine die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Sarah Williams, PhD, van Edanz Group (www.edanzediting.com) voor het redigeren van een concept van dit manuscript.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
