Summary
干细胞作为心肌损伤患者的潜在治疗方法不断被研究，然而，干细胞在损伤组织中生存能力的降低和保留会影响其长期疗效。在这份手稿中，我们描述了一种替代干细胞传递方法，该模型采用缺血再灌注损伤的穆林模型。
Abstract
人们对于使用干细胞（SCs）恢复心肌损伤个体的心脏功能有着浓厚的兴趣。最常见的是，心脏干细胞治疗是通过将SC同时与心肌损伤诱导同时提供来研究。然而，这种方法存在两个显著限制：早期敌对的亲炎缺血环境可能会影响移植的SC的生存，并且它并不代表可能使用SC的亚急性梗塞情景。在这里，我们描述了一个两部分的手术程序系列，用于诱导缺血-再灌注损伤和传递中质干细胞（MSCs）。这种干细胞管理方法可以通过规避最初的免疫反应，使受损组织周围的生存能力和保留时间更长。在小鼠中诱导了缺血再灌注损伤的模型，并伴之以间质干细胞（3.0 x 105），稳定地表达着记者基因萤火虫荧光酶在构成表达CMV促进剂下，7天后在心内。通过超声波和生物发光成像分别对动物进行成像，以确认损伤和细胞注射。重要的是，在执行此两程序方法进行 SC 交付时，没有增加的并发症率。这种干细胞施用方法，与利用最先进的报告基因一起，可能允许在临床上常见的慢性缺血情况下，在体内研究移植的SC的生存能力和保留，同时规避最初的亲炎反应。总之，我们建立了一个协议，延迟将干细胞传递到心肌，这可以用来作为促进受损组织再生的潜在新方法。
Introduction
心血管疾病仍然是全世界发病率和死亡率的最常见原因。心脏缺血事件被发现有害于心肌和周围细胞1的整体功能。只有̴0.45-1.0%的心肌细胞在心肌损伤发生后每年再生。尽管不断增长的需求和固有的重点开发治疗，治疗帮助受伤组织再生已经很难建立，仍然需要进一步优化3，4，5。,4,5干细胞疗法已被引入，作为在缺血事件后恢复受损组织活力的替代途径;然而，这些疗法的进步已经受到有限的生存和保留细胞到受伤区域6的挑战。
缺血事件后心脏的微环境可以定性为缺氧、亲氧化和亲炎，为治疗干细胞适应生存7，8的敌对条件。由于免疫反应在受伤后触发，天真的淋巴细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和乳腺细胞试图通过去除垂死的细胞和调节组织重塑9，10，119,的过程来修复损伤。在缺血后的第一个3天内，炎症处于高峰期，在10，12区释放大量嗜中性粒细胞和单核细胞的亲炎细胞因子。7天后，大部分炎症已经消退，向修复细胞的过渡开始，一直持续到重塑级联完成，大约14天在小鼠13。我们的手术方法是将生物制剂引入心肌中，以绕过缺血再灌注损伤后的峰值先天免疫反应的一种潜在替代方法。同时，它将允许研究任何治疗在亚急性/慢性缺血的情况，其中可能有不同的变量要考虑相比，急性心肌梗死。
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Protocol
实验对雌性C57BL/6小鼠进行，年龄为10-12周，体重为20-25克。所有动物程序均符合《实验室动物护理和使用指南》（美国国家科学院实验室动物资源研究所、美国医学博士所贝塞斯达）中规定的标准，并经梅奥诊所医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 准备和插管
- 手术前将所有手术器械都去处理。如果要在一次手术中进行多次手术，请在每个动物之后清洁仪器，并使用热珠消毒器重新消毒。
- 在感应室中，用 1 L/min O2 的 3.5-4% 异氟兰麻醉小鼠。
- 在皮下管理丁丙诺啡SR 1毫克/千克（镇痛），称量动物，然后将重量输入呼吸机。
- 将胸部左侧从胸骨剃到肩部水平，并涂抹脱毛霜以去除多余的毛皮。
- 对于缺血再灌注程序，在 2 cmH2O 下保持呼吸机上的正端呼出压力 （PEEP）。对于延迟注射细胞的程序将 PEEP 更改为 3 cmH2O，以防止肺衰竭。
- 使用20G气管对动物进行插管，转移到受控加热垫上，以保持35-37°C的体温。
- 将鼠标放在呼吸机上，在横向的直拨处，在左侧的颅端和右侧的颅端。
- 在手术的剩余时间里，在1升/分钟O2时保持2-2.5% 的麻醉。
- 在波维酮-碘和酒精拭子之间交替擦洗手术区域三次，将眼科软膏涂抹到两只眼睛上。
2. 缺血再灌注损伤
- 使用#10刀在视野中最左侧的奶嘴右侧进行垂直切口 2.5 mm。
- 使用剪刀切开表面肌肉层，直到肉间肌肉和肋骨可见。
- 提起肋骨和周围组织时，切开第 4 排骨和 5 根肋骨之间的间空间，然后将眼睑缩回器插入开放空间。
- 使用弯曲钳子收回肺，将肺向上移动并离开视野。
- 可视化LAD动脉，并使用9-0尼龙缝合线，通过动脉下方的肌钙2.5毫米，到左牙，并绑一个松散的方结。
- 切割 1 厘米的聚乙烯管，并放在松动的结中。
- 将缝合线固定在管子周围，确认缺血，35分钟后释放。
注：通过心律失常和心室心律失常确认缺血。 - 松开连接并取出管子后，等待 5 分钟以确认心肌的再灌注。
- 将一个 24 G I.V. 导管管放入胸腔，一个开口右侧的间腔空间。
- 以简单的中断图案，用 6-0 可吸收的缝合线关闭成本间切口。
- 以连续缝合图案用 6-0 可吸收缝合关闭肌肉层。
- 关闭表面肌肉层后，使用 1 mL 结核素注射器从胸腔中抽出空气时，取出胸管。
- 以连续水平床垫图案的 6-0 可吸收缝合关闭皮肤切口
注：尼龙缝合线和不连续缝合图案也可用于皮肤层。 - 以皮下管理1.5 mL的暖盐水，并在切口部位涂抹三联抗生素软膏，防止感染。
- 关闭异氟，让动物通过呼吸机在100%O2 上呼吸，直到它可以在没有辅助的情况下连续呼吸。
- 将鼠标转移到无床上用品的笼子或带盖被铺（纸巾或窗帘）的笼子，放在温度为 35-37 °C 的温垫上，直到完全恢复。
3. 小鼠细胞质干细胞输送
注：用于手术的小鼠菌株是近亲繁殖的线，被认为在基因上相同。从同一菌株的动物身上获得中质干细胞，根据方案设计，免疫抑制没有诱导1。
- 完成第一个过程之前所做的准备和插管步骤。
- 用剪刀和钳子从皮肤层上取下缝合线。
- 用#10手术，在和上一个手术相同的位置做切口。
- 继续使用手术刀切穿疤痕组织，直到肌肉层缝合可见
- 使用剪刀和钳子取出缝合线，将肌肉层切开。
- 可视化并去除将肋骨放在一起的缝合线，然后继续从上一个切口中切开成本间肌肉。
注：肺可能粘附在胸壁上，如果发生这种情况，使用钝或弯曲钳小心分离并释放它们。 - 将眼睑缩回器放入成本间空间，并找到上一个结扎区域。
- 将悬浮在20μL PBS中的中分质干细胞（3.0 x 105）加载到30G胰岛素注射器中，根据需要稍微弯曲针头以进行适当的注射。
注：从4-6周大的C56BL/6小鼠的脂肪组织中分离出月体干细胞（MSCs）。早期通过细胞（p3）被转导，在CMV启动子下用表达萤火虫荧光酶基因的载体进行传化，以允许体内细胞活力监测。脂肪衍生小鼠MSC的特点是流动细胞学，细胞对CD44、CD29、CD90和CD105呈阳性，但造血标记CD4514为阴性。在注射之前，MSC被培养至少一个通道，以避免从解冻过程中细胞损失。 - 从顶点向心脏底部移动，将注射器插入近外侧区域，直到针头开口完全在心肌内。
- 一旦进入慢慢注入细胞到心肌，等待3s，然后取出针。
- 仔细观察心脏3分钟，确保对细胞没有异常反应，如心室颤动。
- 将一个 24 G IV 导管管放入胸腔，在开口右侧放置一个间腔空间。
- 关闭科胸间、肌肉和皮肤层，并采用与第一次手术相同的方法取出胸管。
- 以皮下管理1.5 mL的暖盐水，并在切口部位涂抹三联抗生素软膏，防止感染。
- 关闭异氟，让动物通过呼吸机在100%O2 上呼吸，直到它能够连续呼吸没有援助。
- 将鼠标转移到无床上用品的笼子或带盖被铺（纸巾或窗帘）的笼子，放在温度为 35-37 °C 的温垫上，直到完全恢复。
4. 遵循这两种程序进行术后护理
- 持续观察动物，直到自发呼吸、胸围和正常运动建立。
- 每15-30分钟继续观察，手术当天至少3小时。
- 每天检查小鼠伤口脱皮或异常疼痛5天，然后每周2-3次。
- 如果动物在手术后72小时出现疼痛迹象（即弓背、最小运动、脸色或毛茸茸），请额外服用布丙诺啡SR镇痛剂。
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Representative Results
第0天，小鼠诱发缺血再灌注损伤，在干细胞植入前一天进行术后超声心动图和心电图。超声波和心电图分析证实梗死和心室收缩功能下降（图1A-D）。进一步检查数据显示，接受缺血性损伤的小鼠的弹射分数和分数缩短率降低，而末体舒张和收缩量增加（表1）。与正常小鼠心脏（图2A）相比，马森三色染色心肌组织7天后受伤（图2B）显示胶原蛋白沉积增加，左心室壁变薄。第二个手术在受伤后7天进行;小鼠在细胞内注射间质干细胞（3.0 x 105 在20μL PBS）稳定地表达记者基因萤火虫荧光酶下，构成表达CMV促进。这些小鼠体内生物发光成像（BLI）在干细胞植入后的第二天完成，以确认注射成功。与引起缺血再灌注损伤但未接受MSCs的小鼠相比，BLI信号的成功传递就是例证（图3A，B）。这种双重干预程序的自然减员率为22%，与急性情况下接受MSC的动物的减员率相似。
图1：小鼠心脏功能的成像。 基线（A）对小鼠的超声分析显示，与缺血性再灌注损伤（B）后小鼠相比，左心室心肌均匀收缩，显示心室运动减少。与普通小鼠（C）的基线心电图相比，缺血再灌注损伤（D）小鼠的ST段有显著变化，表明心室功能下降。 请单击此处查看此图的较大版本。
| EF% | FS% | EDV （μl） | ESV （μl） | SV （μl） | |
| 基线 | 74.19±1.2 | 44.67×2 | 23.8×3.6 | 6.14±0.98 | 17.68±2.7 |
| 后红外 | 43.9×3.8 | 30.65×3.8 | 33.88×4.4 | 18.11×1.4 | 15.74±3.2 |
表1：超声心动图分析。 变量表示为均值 = 均值的标准误差。EF： 喷射分数， FS： 分数缩短， EDV： 结束舒张体积， ESV： 结束收缩体积， SV： 描边体积.
图2：心脏组织组织组织染色。 马森在正常小鼠（A）中对心肌的三色染色表明对心脏组织没有损伤，而患有缺血再灌注损伤的小鼠（B）则表明左心室的菌蛋白沉积增加和变薄，支持成功梗死的确定。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：体内生物发光成像。一只没有接受干细胞心肌注射的缺血再灌注损伤的小鼠，没有出现生物发光信号（A）。一只有缺血再灌注损伤的小鼠，接受中质干细胞（CMV-FLUC）的延迟注射，显示出大量信号（B）。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
全世界有8500多万人患有心血管疾病。这些缺血事件的高流行率值得进一步发展和扩大替代疗法，以促进受损组织的再生。传统方法利用缺血再灌注程序在急性环境中，随后给予治疗1。炎症反应处于3-4天之间的高峰期，在心脏缺血事件后，与嗜中性粒细胞，巨噬细胞，和增加细胞因子信号10，12,的渗透。在这一段死细胞脱节后，主要免疫反应开始消退，过渡到重塑阶段13。此外，重要的是，治疗调查在相同的场景，在临床环境中提出。在这份手稿中，我们将展示从缺血小鼠获得的代表性结果，以证明双手术的可行性和安全性，以及延迟注射MSC。我们相信，这种方法不仅可用于心肌缺血动物模型，也可用于动物模型，其中炎症可能发挥关键作用，改变涉及生物制剂的治疗策略的成功，如细胞或药物治疗。
因此，在这份手稿中，我们描述了一种手术方法，用于将干细胞转化为亚急性梗死，在诱导小鼠缺血再灌注损伤后7-10天。这项技术将有助于研究干细胞的生存能力和生物学与免疫反应的不同阶段和缺血性疾病过程的亚急性/慢性阶段有关。Murine 模型是这种研究方法在可重复性和便利性方面的理想主题，但是，它们可能具有一些缺点。动物的大小需要一定的手术技能，虽然，通过实践，这些程序可以成功地完成。
为了执行本手稿中介绍的程序，必须注意一些关键步骤和观察，这些步骤和观察对于成功完成这些手术至关重要。第一个程序的关键步骤是左前下降冠状动脉（LAD）的结扎和聚乙烯管的位置，以实现暂时缺血的心肌。使用无菌锥形尖端棉签对心脏组织施加压力，使LAD的描绘得到加强。一旦管子到位，缝合线紧紧固定，观察心律失常和组织苍白是确定缺血成功诱导的关键。缺血期和随后的再灌注，一旦缝合释放，对于多个动物的伤害的一致性非常重要。此外，在第二个描述过程中，在中质干细胞的注射必须进行水平运动，在近向的两面性方向。由于第一个手术导致纤维化，插入针头需要有显著但稳定的压力，然后缓慢地一致注射细胞以防止休克。最后，在从麻醉中唤醒小鼠之前提供连续加热和补充皮下液体，可防止热量损失，并帮助更换手术过程中失去的任何血液，以及动物的整体恢复。
在这份手稿中，我们提供了一个完成多个程序的协议，作为在慢性缺血再灌注损伤的穆林模型中将干细胞作为治疗治疗的方法。利用这些外科手术为干细胞在受伤后进入敌对缺血环境提供了一种新方法，可随着时间的推移提高其生存能力。将这种方法用于干细胞治疗的研究将大大补充其他专注于在急性环境中使用SC的研究。总之，所述方案成功地诱导缺血性损伤和随后的延迟植入干细胞，用作临床前研究的模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl Irrigation, USP | Baxter | 0338-0048-04 | |
| 11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable | SAI Infusion Technologies | PSS-SD | |
| 24G 3/4" IV catheter tube | Jelco | 4053 | |
| 28G x 1/2" 1mL allergy syringe | BD | 305500 | Injection of analgesic |
| 30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe | Ulticare | 08222.0933.56 | Injection of stem cells |
| 6-0 S-29, 12" Vicryl suture | Ethicon | J556G | Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure |
| 9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture | Ethicon | 2829G | Ligation of the LAD artery |
| Absorbent underpad | Thermo Fischer Scientific | 14-206-64 | For underneath the animal |
| Alcohol prep pads, 2 ply, medium | Coviden | 6818 | |
| Anti-fog face mask | Halyard | 49235 | |
| Bonn Strabismus scissors, curved, blunt | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity). | |
| Castroviejo needle holders, curved | Fine Science Tools | 12061-01 | |
| Curity sterile gauze sponges | Coviden | 397310 | |
| Delicate suture tying forceps, 45 angle bent | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Electric Razor | Wahl | Fur removal | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Health | PI23238 | Anesthetic |
| Lab coat | |||
| Monoject 1 mL hypodermic syringe | Coviden | 8881501400 | |
| Moria iris forceps, curved, serrated (x2) | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Moria speculum retractor | Fine Science Tools | 17370-53 | |
| Mouse endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ||
| Nair depilatory cream | Johnson & Johnson | Fur removal | |
| Optixcare eye lube plus | Aventix | Sterile ocular lubricant | |
| Physiosuite ventilator | Kent Scientific | ||
| PolyE Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 72-0191 | Temporary compression of LAD artery |
| Povidone-iodine swabs | PDI | S41125 | |
| Scalpel, 10-blade | Bard-Parker | 371610 | |
| Sterile 3" cotton tipped applicators | Cardinal Health | C15055-003 | |
| Sterile 6" tapered cotton tip applicators | Puritan | 25-826-5WC | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | N8830 | |
| Sterilization pouches | Medline | MPP100525GS | |
| Surgery cap | |||
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Suture tying forceps, straight (x2) | Fine Science Tools | 10825-10 | |
| Transpore surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Triple antibiotic ointment | G&W Laboratories | 11-2683ILNC2 | Topical application to prevent infection |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Vetflo vaporizer | Kent Scientific |
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