SEC-BioSAXS-mätningar av biologiska makromolekyler är ett standardansats för bestämning av lösningsstruktur hos makromolekyler och deras komplex. Här analyserar vi SEC-BioSAXS data från två typer av vanligt påträffade SEC-spår-kromatogram med helt lösta och delvis lösta toppar. Vi demonstrerar analysen och deconvolutionen med hjälp av scatter och BioXTAS RAW.
BioSAXS är en populär teknik som används inom molekylär- och strukturbiologi för att bestämma lösningsstruktur, partikelstorlek och -form, yt-till-volym-förhållande och konformationsförändringar av makromolekyler och makromolekylära komplex. En hög kvalitet SAXS-datauppsättning för strukturell modellering måste vara från monodisperse, homogena prover och detta nås ofta endast genom en kombination av inlinekromatografi och omedelbar SAXS-mätning. Oftast används storleksutesläckningskromatografi för att separera prover och utesluta föroreningar och aggregeringar från den partikel av intresse som gör att SAXS-mätningar kan göras från en väl löst kromatografisk topp av en enda proteinart. Fortfarande, i vissa fall, även inline rening är inte en garanti för monodisperse prover, antingen för att flera komponenter är för nära varandra i storlek eller förändringar i form inducerad genom bindande ändra upplevd elution tid. I dessa fall kan det vara möjligt att dekonvolera SAXS-data av en blandning för att få de idealiserade SAXS kurvor av enskilda komponenter. Här visar vi hur detta uppnås och den praktiska analysen av SEC-SAXS-data utförs på ideala och svåra prover. Specifikt visar vi SEC-SAXS analys av vaccinia E9 DNA polymeras exonuclease minus mutant.
Biologiska makromolekyler är för små för att ses även med de bästa ljusmikroskopen. Nuvarande metoder för att bestämma sina strukturer innebär i allmänhet kristallisera protein eller mätningar på stort antal identiska molekyler samtidigt. Medan kristallografi ger information om atomnivå, representerar det en konstgjord provmiljö, med tanke på att de flesta makromolekyler inte presenteras i en kristallin form i cellen. Under de senaste åren cryo-elektronmikroskopi levererade liknande högupplösta strukturer av stora makromolekyler / makromolekylära komplex, men även om proverna är närmare fysiologiskt tillstånd, de är fortfarande frysta, därav orörliga och statiska. Bio-small vinkelröntgenspridning (BioSAXS) ger en strukturell mätning av makromolekylen, under förhållanden som är relevanta för biologi. Detta tillstånd kan visualiseras som en låg upplösning 3D-form bestäms på nanometer skala och fångar hela konformational utrymme av makromolekylen i lösning. BioSAXS experiment bedömer effektivt oligomeriska tillstånd, domän och komplexa arrangemang samt flexibilitet mellandomänerna 1,2,3. Metoden är korrekt, mestadels icke-förstörande och kräver vanligtvis endast ett minimum av provberedning och tid. För bästa tolkning av uppgifterna behöver dock proverna vara monodisperse. Detta är utmanande; biologiska molekyler är ofta mottagliga för föroreningar, dålig rening och aggregering, till exempel från frys upptining4. Utvecklingen av inlinekromatografi följt av omedelbar SAXS-mätning hjälper till att mildra dessa effekter. Storlek-uteslutande kromatografi separerar proverna efter storlek så utesluter de flesta föroreningar och aggregeringar5,6,7,8,9,10. Men i vissa fall även SEC-SAXS är inte tillräcklig för att producera en monodisperse prov, eftersom blandningen kan bestå av komponenter som är för nära i storlek eller deras fysiska egenskaper eller deras snabba dynamik leda till överlappande toppar i SEC UV-spår. I dessa fall kan ett programvarubaserat deconvolution-steg av de erhållna SAXS-data leda till en idealiserad SAXS-kurva för den enskildakomponenten 5,11,12. Som ett exempel, i protokoll avsnitt 2, visar vi standard SEC-SAXS analys av vaccinia E9 DNA-polymeras exonuclease minus mutant (E9 exominus) i komplex med DNA. Vaccinia representerar modellorganismen hos Poxviridae, en familj som innehåller flera patogener, till exempel humant smittkoppsvirus. Polymerasen visade sig binda tätt till DNA i biokemiska metoder, med strukturen av komplexet nyligen löst genom röntgenkristallografi13.
De flesta synkrotronanläggningar kommer att ge en automatiserad databehandlingspipeline som kommer att utföra data normalisering och integration producerar en uppsättning av oskickade ramar. Men det tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript kan också användas med en labbkälla förutsatt att SEC-SAXS utförs. Vidare kan ytterligare automatisering finnas tillgänglig som kommer att avvisa strålningsskadade ramar och utföra bufferten subtraktion14. Vi kommer att visa hur man utför primärdataanalys på förbelagade data och får ut det mesta av tillgängliga data i avsnitt 2.
I avsnitt 3 visar vi hur man dekonvolerar SEC-SAXS-data och analyserar kurvorna effektivt. Medan det finns flera deconvolution metoder såsom Gaussiska topp deconvolution, genomförs i US-SOMO15 och Guinier optimerad maximal sannolikhet metod, genomförs i DELA programvara16, dessa kräver i allmänhet en modell för toppform12. Den ändliga storleken på enskilda toppar vi undersöker tillåter användning av evolverande faktoranalys (EFA), som en förbättrad form av singular värdeförmultning (SVD) för att dekonvolutera överlappande toppar, utan att förlita sig på toppformen eller spridningsprofilen5,11. En SAXS-specifik implementering finns i BioXTAS RAW17. EFA användes först på kromatografidata när 2D-diodmatrisdata tillät att matriser bildades från absorbans mot retentionstid och våglängdsdata18. Där EFA utmärker sig är att det fokuserar på den föränderliga karaktären av singularvärden, hur de förändras med utseendet på nya komponenter, med förbehållet att det finns en inneboende ordning iförvärvet 10. Lyckligtvis ger SEC-SAXS-data alla nödvändiga beställda förvärvsdata i organiserade 2D-datamatriser, utlåning sig fint till EFA-tekniken.
I avsnitt 4 kommer vi att visa grunderna för modelloberoende SAXS-analys från buffert-bakgrund subtraherade SAXS-kurvan. Modelloberoende analys bestämmer partikelns radie-av-gyration (Rg), volym-av-korrelation (Vc), Porod Volym (Vp), och Porod-Debye Exponent (PE). Analysen ger en semi-kvantitativ bedömning av partikelns termodynamiska tillstånd vad gäller kompakthet eller flexibilitet via den dimensionslösa Kratky-tomten2,4,19.
Slutligen, SAXS data mäts i ömsesidiga rymdenheter och vi kommer att visa hur man omvandlar SAXS-data till real-space för att återställa par-avstånd, P(r), fördelningsfunktion. P(r)-fördelningen är uppsättningen av alla avstånd som finns inom partikeln och inkluderar partikelns maximala dimension, dmax. Eftersom detta är en termodynamisk mätning, representerar P(r)-fördelningen det fysiska utrymme som upptas av partiklarnas konformationsutrymme. Korrekt analys av en SAXS-datauppsättning kan ge lösning-tillstånd insikter som kompletterar högupplöst information från kristallografi och cryo-EM.
Det är önskat att ha en monodisperse prov innan du startar ett SAXS experiment, men i verkligheten, många datainsamlingar inte uppfyller detta och måste förbättras genom att kombinera mätningen med inline kromatografi-SEK i de flesta fall. Men även bristen på tid mellan rening och datainhämtning monodispersity av provet är inte garanterat. Vanligast gäller detta experiment där komponenter är för nära i storlek eller i sina fysiska egenskaper för att separeras eller är benägna att snabb dynamik. Här har vi lämnat ett protokoll som kombinerar ett värde nedbrytning med utvecklande faktor analys för att ta bort påverkan av DNAbound E9 exominus från dess obundna skapa en monodisperse spridning profil som vi sedan kunde analysera med SAXS paketet Scatter IV.
SVD med EFA av SEC-SAXS-data är mycket kraftfulla metoder som utvecklats för att dekonvolera SAXS-data och förbättra analysen, men de har begränsningar. De kräver att buller eller avdrift i bufferten baslinjen för SEC-SAXS hålls till ett minimum. Detta kan innebära extra kolumn jämvikt (bättre att använda mer än 3 kolumn volymer, beroende på buffert) innan prov lastning. Det mest kritiska steget är dock valet av antalet singularvärden och det dataintervall som används, eftersom detta i hög grad kommer att påverka deconvolutionens riktighet. Det är av denna anledning som resultaten inte bör tas på egen hand utan ytterligare analyseras med hjälp av tekniker som analytiska ultracentrifugering (AUC) eller multi-vinkel-laser-ljus-spridning (MALLS) för biologisk tolkning.
Scatter IV är ett nytt, programpaket, gratis för forskning och industriell användning med ett intuitivt användargränssnitt som gör att även icke-experter kan analysera sina data. Scatter IV har flera nya funktioner som bidrar till att förbättra analysen av SEC-SAXS-data, till exempel värmekartan kopplad till signaltomten, vilket möjliggör större noggrannhet med val av val av ram. I primära dataanalys, Guinier Peak analys och korsvalidering tomten i samband med P(r) analys erbjuder en integrerad felsökning förmåga i programvaran.
Det bör nämnas att många andra program kan användas för primärdataanalys; dessa innehåller samma grundläggande funktioner och uppdateras också regelbundet såsom BioXTAS RAW17 ATSAS paket24 och US-SOMO15 för att nämna några.
Men oavsett vilket SAXS-paket som används för analys, är de stora begränsningarna vanliga: provberedningen, före insamling och analys. I E9 exominus exempel visas, är det tydligt att se förbättringen av förhållandet signal till brus och med en minskning av Rg den dmax i samband med en monodisperse prov. Detta kommer i hög grad att bidra till ytterligare behandling av uppgifterna såsom montering eller modellering med kända högupplösta strukturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner det ekonomiska stödet till projektet från det franska bidraget REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 och genom forskningsanslag från Service de Santé des Armées och Délégation Générale pour l’Armement. Vi är tacksamma mot ESRF för SAXS-stråltiden. Detta arbete använde plattformarna av Grenobleen Instruera-ERIC centrerar (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) inom Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), med stöd av FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) och GRAL, finansieras inom universitetet Grenoble Alpes forskarskola (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS erkänner integrationen i det tvärvetenskapliga forskningsinstitutet i Grenoble (IRIG, CEA). Vi tackar Wim P. Burmeister och Frédéric Iseni för ekonomiskt och vetenskapligt stöd och vi tackar även Dr Jesse Hopkins från BioCAT vid APS för hans hjälp och för att utveckla BioXTAS RAW.
Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |