इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों को वर्जीनिया विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित और पालन किया जाता है। नोट: बाद के विश्लेषण चरणों के लिए विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण नियंत्रण हैं, जिन्हें तालिका 1 में सारांशित किया गया है और लिपोसोम प्रशासन से पहले विचार किया जाना चाहिए। 1. कैल्शियम एसीटेट और टेसाग्लिटाज़र से भरे फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लिपोसोम की तैयारी डीएसपीसी (1,2-डिस्टीयरॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन), कोलेस्ट्रॉल, पीईजी -2000-डीएसपीई और डीआईडी को मिलाएं। इसके लिए, डीएसपीसी, कोलेस्ट्रॉल और पीईजी -2000 डीएसपीई को 2: 1: 1 के द्रव्यमान अनुपात में मिलाएं। लिपोसोम के प्रति 1 एमएल डीआईडी (डीएसपीसी: डीआईडी के 46: 1 का दाढ़ अनुपात) की एकाग्रता पर डीआईडी लिपिड डाई जोड़ें।नोट: डीआईडी 1,1′-डाइऑक्टेडेसिल-3,3,3′, 3’टेट्रामेथिलिन्डोकार्बोसाइनिन डाई के लिए एक स्वीकृत संक्षिप्त नाम है। चूंकि इसमें इस फॉर्मूलेशन में उपयोग किए जाने वाले डीएसपीसी के बराबर लंबाई के दो ऑक्टाडेसिल “फैटी टेल” हैं, इसलिए इसे ज्यादातर लिपिड झिल्ली में शामिल करना चाहिए। डीआईओ, डीआईडी और डीआईआई जैसे लिपिड रंगों का उपयोग नियमित रूप से लिपोसोम अनुसंधान8 के लिए किया जाता है और उन्हें गैर-विनिमय योग्यमाना जाता है। उल्टे चरण इमल्शन और लिपोसोम तैयारी के लिए 20 एमएल सिंटिलेशन शीशी का उपयोग करें। इस शीशी में, जलीय कैल्शियम एसीटेट (सीए-एसीटेट, 1 एम, पीएच 7.4) के साथ लिपिड के 2: 1 ईथर-क्लोरोफॉर्म समाधान को मिलाएं। कार्बनिक और जलीय चरण के बीच का अनुपात 4: 1 होना चाहिए, उदाहरण के लिए, कार्बनिक चरण के 4 एमएल और जलीय चरण के 1 एमएल। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए सोनिकेशन द्वारा लिपिड के ईथर-क्लोरोफॉर्म समाधान का अनुकरण करें। सोनिकेटर को 20 KHz और 50% पावर पर संचालित करें और 1/2 इंच का उपयोग करें। सलाई।नोट: फोमिंग से बचने के लिए सोनिकेटर प्रोब की नोक को शीशी के तल के करीब रखें। सोनिकेशन के दौरान प्रोब टिप के साथ ग्लास को न छुएं, यह टूट सकता है। इसके अतिरिक्त, क्लोरोफॉर्म को सह-विलायक के रूप में ईथर में जोड़ा जाना चाहिए: कोलेस्ट्रॉल की उपस्थिति में, एक ईथर-केवल इमल्शन तेजी से अलग हो जाता है, जिससे प्रक्रिया का यह चरण असंभव हो जाता है। शीशी को तुरंत एक विशेष एडाप्टर, मैनोमीटर गेज और एक दबाव नियामक वाल्व के साथ रोटरी बाष्पीकरणकर्ता पर समरूप पानी-इन-ऑयल इमल्शन के साथ रखें। कार्बनिक सॉल्वैंट्स को हटाने के लिए बाष्पीकरणकर्ता को वैक्यूम लाइन से जोड़ा जाना चाहिए। रोटेशन दर को 100 आरपीएम पर और वैक्यूम को 0.5 एटीएम पर सेट करें, और यदि इमल्शन फोमिंग अत्यधिक दिखती है तो छोड़ दें। एक जेल बनने और गायब होने के बाद, वैक्यूम को 0.9 एटीएम तक बढ़ाएं।नोट: वाष्पशील कार्बनिक चरण हटाने के दौरान, वैक्यूम स्तर को धीरे-धीरे समायोजित किया जाना चाहिए, ताकि तेजी से फोमिंग से बचा जा सके, क्योंकि इससे शीशी से रोटरी बाष्पीकरणकर्ता के शरीर में सामग्री का नुकसान हो सकता है। आखिरकार, जब ईथर और क्लोरोफॉर्म आंशिक रूप से वाष्पित हो जाते हैं और जलीय और कार्बनिक विलायक चरण के बीच मात्रा अनुपात 1: 1 के करीब होता है, तो एक जेल बनेगा। वाष्पीकरण तब तक जारी रहना चाहिए जब तक कि जेल गायब न हो जाए और शेष जलीय मीडिया फिर से पूरी तरह से तरल हो जाए। अतिरिक्त मिश्रण कार्बनिक विलायक हटाने में तेजी लाने में मदद कर सकता है। रोटरी वाष्पीकरण के दौरान चिपचिपा जेल के संवहन को बढ़ाने के लिए, वाष्पीकरण फ्लास्क में एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन हलचल बार रखकर इसे प्राप्त किया जा सकता है। सजातीय आकार वितरण प्राप्त करने के लिए ट्रैक-अंकित पॉली कार्बोनेट झिल्ली का उपयोग करके परिणामी लिपोसोम को फ़िल्टर करें।दो गैस-तंग सिरिंज से लैस लिपोसोम एक्सट्रूडर में 200 एनएम-पोर पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से लिपोसोम जलीय फैलाव को कई बार आगे और पीछे पारित करके निस्पंदन करें।नोट: छोटे सिरिंज को प्राथमिकता दी जाती है (जैसे, 0.5 एमएल) क्योंकि वे निस्पंदन के लिए पर्याप्त दबाव पैदा करने का आश्वासन देते हैं। लिपोसोम झिल्ली में उच्च कोलेस्ट्रॉल सामग्री के साथ, एक उच्च तापमान आवश्यक नहीं है, और प्रक्रिया कमरे के तापमान पर की जा सकती है। निस्पंदन की एक विषम संख्या (जैसे, 21) का प्रदर्शन किया जाता है, ताकि परिणामी सामग्री शुरू से ही फिल्टर के विपरीत दिशा में समाप्त हो जाए और यदि पूर्व-निष्फल किया जाए, तो फ़िल्टर किए गए आकार समायोजित-लिपोसोम का बाँझ नमूना एकत्र किया जा सके। परिणामी लिपोसोम का आकार आमतौर पर चयनित फिल्टर छिद्र आकार के करीब होता है। कम कण आकार के लिए ठीक समायोजन करने के लिए दो फिल्टर (एक के बजाय) ढेर किए जा सकते हैं। गतिशील लेजर प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) 3,4 का उपयोग कर आकार वितरण की पुष्टि करें।चार पारदर्शी भुजाओं के साथ 1 सेमी क्यूवेट में 1 से 3 मिलीलीटर खारा जोड़ें। उसके लिए, लिपोसोम के 10-20 μL जोड़ें और सावधानी से मिलाएं। नमूने को उपकरण में रखें और मापने के लिए निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: विलायक चिपचिपाहट, अपवर्तक सूचकांक, लिपिड का अपवर्तक सूचकांक। प्रारंभ करें बटन क्लिक करें. माप कई मिनट तक चलेगा और इसमें 100 या अधिक रन शामिल होंगे। डीसाल्टिंग स्पिन-कॉलम का उपयोग करके बाहरी सीए-एसीटेट को हटा दें। बैच के आधे हिस्से में, 10 एमएम एचईपीईएस बफर (पीएच 7.4) में जलीय टेसाग्लिटाज़र जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण के साथ इनक्यूबेट करें। दवा मुक्त नियंत्रण लिपोसोम फॉर्मूलेशन के रूप में बैच के दूसरे भाग का उपयोग करें।नोट: उपयोग से पहले 10 एमएम एचईपीईएस बफर, पीएच 7.4 के साथ 2-एमएल डीसाल्टिंग स्पिन-कॉलम को पूर्व-समतुल्य करें। ऐसा करने के लिए, कॉलम में 1 एमएल एचईपीईएस बफर रखें और 2 मिनट के लिए 1000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें। पास-थ्रू बफर को हटा दें और इसे चार बार दोहराएं। 2 एमएल स्पिन-कॉलम का उपयोग करके लिपोसोम ्स से अनट्रैप्ड टेसाग्लिटाज़र को हटा दें, और संलग्न दवा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से एकाग्रता निर्धारित करें। सूखे कॉलम जेल बिस्तर में लिपोसोम नमूने के 0.5 मिलीलीटर से अधिक न जोड़ें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी नमूने जेल में प्रवेश न कर लें। सेंट्रीफ्यूज पहले (1000 x ग्राम, 2 मिनट) के समान स्थितियों में और छोटे आणविक द्रव्यमान यौगिकों से शुद्ध पास-थ्रू में लिपोसोम नमूना एकत्र करते हैं। अंतिम कण विशेषताओं की मात्रा निर्धारित करें: डीएलएस और जेटा क्षमता का उपयोग करके कण आकार और एकाग्रता एक संयुक्त डीएलएस-इलेक्ट्रोफोरेक्टिक लाइट स्कैटरिंग (ईएलएस) प्रणाली 3,4 में 10 एमएम एचईपीईएस बफर पीएच 7.4 और 25 डिग्री सेल्सियस पर।चरण 1.5.2 के समान, माप बफर में लिपोसोम फैलाव (जैसे, 10 μL लिपोसोम प्रति 1 मिलीलीटर बफर घोल) को एक डिस्पोजेबल ल्यूर सिरिंज, या कट टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके यू-आकार के क्यूवेट में पतला करें। सुनिश्चित करें कि “यू” में कोई बुलबुले नहीं हैं ताकि विद्युत प्रवाह प्रवाह के लिए निर्बाध समाधान हो। क्यूवेट को इकाई में रखें (कृपया क्यूवेट के सामने और पीछे ध्यान दें, ताकि इलेक्ट्रोड यूनिट से ठीक से जुड़े हों)। उपकरण का दरवाजा बंद करें; इसके बाद, माप (कई दोहराव के साथ), मार्गदर्शन सॉफ्टवेयर के नियंत्रण में होता है। 2. विवो प्रशासन में लिपोसोम तैयार करें एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, विवो प्रशासन के लिए 50 μL की अंतिम मात्रा में उचित एकाग्रता के लिए बाँझ लवण में लिपोसोम को पतला करें।नोट: पिछले अध्ययनों में, हमारी लिपोसोम तैयारी में 2 मिलीग्राम / एमएल टेसाग्लिटाज़र शामिल था, जो टेसाग्लिटाज़र / एमएल के लगभग 4.89 μmol के बराबर होता है, और हमने लिपोसोम को 1 μmol दवा / kg की खुराक पर प्रशासित किया। 40 ग्राम माउस के लिए, हम खारा में 50 μL की अंतिम मात्रा तक लिपोसोम के 8.2 μL लाएंगे। डीएलएस / ईएलएस का उपयोग करते हुए, दवा- और वाहन-लोडेड लिपोसोम की तैयारी के लिए प्रति यूनिट मात्रा में लिपोसोम की संख्या भी निर्धारित की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दवा-लोडेड लिपोसोम की तुलना में माउस वजन के प्रति ग्राम वाहन लिपोसोम की समान संख्या प्रशासित की जाती है। बायोसेफ्टी कैबिनेट में लिपोसोम घोल को 27 ग्राम सुई में लोड करें। माउस में ठंडे घोल को इंजेक्ट करने से बचने के लिए इसे कमरे के तापमान पर रखें। 3. रेट्रो-ऑर्बिटल अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से लिपोसोम का प्रशासन करें नोट: अन्य तरीकों से अंतःशिरा इंजेक्शन का संचालन करना भी उचित है, जैसे कि पूंछ शिरा इंजेक्शन यदि इसे पसंद किया जाता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में कवर नहीं किया गया है, इस विधि को समझाने वाले प्रकाशित प्रोटोकॉल19 उपलब्ध हैं। लिपोसोम वितरित करने के लिए कार्यस्थान सेट करें।वर्कबेंच को 70% इथेनॉल से साफ करें। एक ऐसी जगह का चयन करना सुनिश्चित करें जो आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया सिस्टम के उपयोग की अनुमति देता है। एक वार्मिंग पैड चालू करें और माउस को साफ सतह पर रखने के लिए उसके ऊपर एक साफ पैड या तौलिया रखें। चूहों के साथ काम शुरू करने से पहले पैड को गर्म करने के लिए पर्याप्त समय दें। संज्ञाहरण प्रणाली स्थापित करें ताकि कक्ष पास हो और नाक शंकु वार्मिंग पैड पर हो।सुनिश्चित करें कि सिस्टम के अन्य सभी पहलू तैयार हैं (उदाहरण के लिए, वेपोराइज़र में आइसोफ्लुरेन का स्तर काफी अधिक है, चारकोल फिल्टर का वजन किया गया है, ट्यूबिंग सही ढंग से जुड़ा हुआ है)। प्रोटोकॉल के इस खंड के लिए आवश्यक अन्य सामग्रियों को इकट्ठा करें: नेत्र स्नेहक जेल, पोस्ट-प्रशासन उपचार के लिए एक स्थानीय एनेस्थेटिक, बाँझ धुंध पैड। प्रेरण कक्ष में आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को सेडेट करें। एक बार जब यह एक कोमल पैर टैप के प्रति अनुत्तरदायी होता है, तो नाक शंकु के माध्यम से बेहोश करने की क्रिया को बनाए रखते हुए माउस को जल्दी से कार्यक्षेत्र में स्थानांतरित करें।नोट: पशु को 1.5% से 2.5% आइसोफ्लुरेन पर बनाए रखा जाना चाहिए और प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले संज्ञाहरण की उचित गहराई (पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी के माध्यम से) के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। लिपोसोम प्रशासन के लिए माउस को एक तरफ स्थानांतरित करें। क्योंकि एनेस्थेटाइज्ड होने पर माउस पलक नहीं झपकाएगा, प्रक्रिया के शेष के दौरान उन्हें मॉइस्चराइज रखने के लिए दोनों आंखों पर थोड़ी मात्रा में नेत्र स्नेहक लागू करें। उजागर आंख के ऊपर और नीचे की त्वचा पर धीरे से दबाएं। आंख को चेहरे के तल से ऊपर उठाना चाहिए। ध्यान से सुई की नोक को औसत दर्जे के कैंथस पर डालें, यह सुनिश्चित करें कि सुई आंख के नीचे है और इसे छू नहीं रही है। एक बार जब सुई आंख के नीचे डाली जाती है, तो धीरे-धीरे लिपोसोम को रेट्रो-ऑर्बिटल स्पेस में इंजेक्ट करें। सुई वापस लेने पर, हेमोस्टेसिस प्राप्त करने के लिए पलकें कुछ सेकंड के लिए बंद करना आवश्यक हो सकता है।यदि सुई को पर्याप्त रूप से अंदर नहीं डाला जाता है, तो समाधान आंख के चारों ओर उभर सकता है। यदि यह देखा जाता है तो तुरंत इंजेक्शन लगाना बंद कर दें और सुई को फिर से रखें। प्रक्रिया के बाद के दर्द और असुविधा को रोकने के लिए आंखों पर एक स्थानीय एनेस्थेटिक, जैसे कि प्रोपाराकेन लागू करें। माउस को एक वार्मिंग पैड पर रखें और निगरानी करें जब तक कि यह यह सुनिश्चित करने के लिए जागृत न हो जाए कि यह अच्छी तरह से है और शरीर का उचित तापमान बनाए रखता है। माउस को उसके पिंजरे और उसके सामान्य आवास वातावरण में वापस करें जब तक कि रुचि का समय बिंदु न आ जाए।नोट: यह स्थानीय IACUC दिशानिर्देशों के अनुरूप किया जाना चाहिए। 4. ऊतक फसल, ऊतक प्रसंस्करण और फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए सामग्री तैयार करें फसल, प्रसंस्करण और धुंधलापन के लिए समाधान तैयार करें (खंड 5-7): फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस)-हेपरिन, एचईपीईएस बफर, 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस टाइप 1, एकेसी लाइसिस बफर, एफएसीएस बफर, पीबीएस, फिक्सेशन बफर (तालिका 2)। प्रक्रिया के दौरान निर्धारण बफर को छोड़कर सभी समाधानों को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखें। कटाई और प्रसंस्करण ऊतकों के लिए बफर और अन्य सामग्रियों के साथ ट्यूब तैयार करें।प्रत्येक माउस से रक्त के लिए, रक्त एकत्र करने के लिए 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.5 एम ईडीटीए के 10 μL जोड़ें। ईडीटीए रक्त को थक्के बनने से रोकेगा। 25 ग्राम सुई और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के साथ 1 एमएल सिरिंज की भी आवश्यकता होती है। प्लीहा के लिए, एक 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 1 एमएल एचईपीईएस बफर, एक 1 एमएल सिरिंज, दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, और प्रति प्लीहा दो 70 μm फिल्टर के साथ इकट्ठा करें। प्रत्येक वसा ऊतक डिपो के लिए, ऊतक को कम करने के लिए 1.5 एमएल एचईपीईएस बफर के साथ 20 एमएल पॉलीथीन शीशी, एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, और प्रति माउस प्रति वसा ऊतक प्रकार 70 μm फ़िल्टर इकट्ठा करें। फसल के लिए कार्यक्षेत्र तैयार करें।70% इथेनॉल के साथ बेंच स्पेस को साफ करें। फसल के दौरान माउस को पिन करने के लिए एक रबर ट्रे तैयार करें, इसे 70% इथेनॉल के साथ साफ करके और इसे शोषक पैड या पेपर तौलिए के साथ कवर करके। सुनिश्चित करें कि कम से कम 5 पिन काम करने के लिए उपलब्ध हैं। पीबीएस-हेपरिन के साथ 10 एमएल सिरिंज भरें और छिड़काव के लिए 25 ग्राम सुई पर बांधें। फसल के दौरान उपयोग करने के लिए उपकरण और सामग्री इकट्ठा करें। फोर्सेस (दो जोड़े), कैंची, पेपर तौलिए, लिंट-फ्री वाइप्स, ईडीटीए के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (एस), एचईपीईएस बफर के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (एस), और एचईपीईएस बफर के साथ पॉलीथीन शीशी (एस) की आवश्यकता होती है। 5. ऊतकों की कटाई सीओ2 श्वासावरोध द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का संचालन न करें क्योंकि यह बाद के चरणों में प्रभावी रक्त संग्रह और ऊतक छिड़काव को रोक सकता है। माउस को अच्छी तरह से देखने के लिए पर्याप्त कामकाजी स्थान और प्रकाश व्यवस्था के साथ एक साफ किए गए बेंच क्षेत्र में, एक रबर विच्छेदन ट्रे, नमूने संग्रहीत करने के लिए बर्फ की एक बाल्टी और 70% इथेनॉल के साथ एक स्प्रे बोतल स्थापित करें। संदूषण को कम करने और बालों के प्रसार को नियंत्रित करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस को स्प्रे करें। रबर ट्रे पर अपनी पीठ पर माउस रखें और उसके शरीर से दूर फैले अपने पंजे को पिन करें। रक्त एकत्र करने की तैयारी के लिए, माउस के रिबकेज के पुच्छल छोर के किनारे पर त्वचा में सावधानीपूर्वक चीरा लगाएं। माउस के सिर (लगभग 1 सेमी) की ओर एक छोटी, सीधी रेखा काटें जब तक कि पेक्टोरिस मांसपेशियां उजागर न हों।प्रारंभिक चीरा स्थल पर, सिर की ओर रेखा के लंबवत दो छोटे कट बनाएं। फिर, उजागर क्षेत्र में पसली पिंजरे के एक तरफ पेक्टोरिस मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक काट दें। यह बेहतर पहुंच और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है जहां सुई डाली जानी चाहिए। रक्त एकत्र करने के लिए, सुई को उस तरफ तीसरी और चौथी पसलियों के बीच डालें जहां मांसपेशियों को हटा दिया गया था। चूंकि माउस का दिल छाती गुहा के केंद्र में पाया जाता है, इसलिए सुई को यथासंभव पसली पिंजरे की केंद्र रेखा के करीब रखें। एक बार डालने के बाद, रक्त एकत्र करना शुरू करने के लिए धीरे से सिरिंज पर खींचें। एक बार एकत्र होने के बाद, रक्त को ईडीटीए के साथ तैयार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर स्टोर करें।नोट: यदि लगभग 100 μL की मात्रा खींची जाती है और सिरिंज में कोई रक्त प्रवेश नहीं करता है, तो सुई खुलने की स्थिति में सिरिंज को दाईं या बाईं ओर घुमाने का प्रयास करें। यदि यह मदद नहीं करता है, तो धीरे-धीरे सुई को छाती गुहा में आगे ले जाएं या निकालना शुरू करें। यदि इस बिंदु पर सिरिंज में रक्त इकट्ठा होना शुरू हो जाता है, तो धीरे-धीरे सिरिंज पर वापस खींचना जारी रखें। सफल निष्कर्षण के लिए सिरिंज और सुई को घुमाने पर विचार करें। अंत में, यदि कोई रक्त एकत्र नहीं किया जाता है, तो सुई को हटा दें क्योंकि यह दिल से चूक सकता है। सुई को फिर से डालने और उपरोक्त प्रक्रिया को फिर से दोहराने का प्रयास करें। इसके बाद, माउस को घुमाने के लिए, हृदय तक पहुंचने के लिए छाती गुहा खोलें।ऐसा करने के लिए, पसली पिंजरे के अंत में त्वचा को प्रत्येक तरफ माउस की तरफ से काट लें। फिर, उरोस्थि को काम की सतह से दूर रखने के लिए बल का उपयोग करें। पेरिटोनियल गुहा को काटने के लिए उरोस्थि के अंत के ठीक नीचे एक छोटा, उथला चीरा लगाएं। माउस के प्रत्येक तरफ पसली पिंजरे के अंत में पेरिटोनियल झिल्ली के साथ काटें। यह यकृत और पित्ताशय की थैली को उजागर करना चाहिए। सावधान रहें कि इन ऊतकों में से किसी में भी कटौती न करें। इसके बाद, डायाफ्राम में एक छोटा, उथला कट बनाएं, यकृत के लिए कपाल। फिर, छाती गुहा को खोलने के लिए पसली पिंजरे के किनारे के साथ डायाफ्राम को काट लें। छाती गुहा के भीतर किसी भी अंग को काटने से बचना सुनिश्चित करें। माउस की केंद्र रेखा से लगभग 2-3 मिमी और लगभग 0.75 सेमी लंबे सिर की ओर पसली पिंजरे के साथ दो कट बनाएं।नोट: यदि बहुत अधिक काटा जाता है, तो पसली पिंजरे के शीर्ष पर रहने वाली धमनियों को काट दिया जाएगा। यह छिड़काव की प्रभावकारिता में हस्तक्षेप करेगा। छाती गुहा को उजागर करने के लिए पसली पिंजरे के केंद्र के टुकड़े को वापस उठाएं। दिल तक पहुंचने के लिए किसी भी वसा या ऊतक को दूर ले जाएं। माउस के दिल के दाहिने आलिंद में एक छोटा सा कट बनाएं ताकि एक उद्घाटन बनाया जा सके जिसके माध्यम से रक्त को बाहर धकेला जा सके। पीबीएस-हेपरिन के 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, माउस के दिल के बाएं वेंट्रिकल में सुई डालें। धीरे से पीबीएस को दिल में धीरे-धीरे धकेलना शुरू करें।नोट: रक्त को दाहिने एट्रिया से उभरते हुए और छाती गुहा को भरते हुए देखा जाना चाहिए। महाधमनी के माध्यम से हृदय से पीबीएस-हेपरिन के प्रवाह को बाधित करने से बचने के लिए हृदय को उसके शारीरिक स्थान पर रखना सुनिश्चित करें। एक बार जब पीबीएस-हेपरिन के सभी 10 एमएल माउस के माध्यम से संक्रमित हो जाते हैं, तो सिरिंज और सुई को छोड़ दें और पेपर तौलिए या लिंट-फ्री वाइप्स का उपयोग करके छाती गुहा से अतिरिक्त रक्त और पीबीएस-हेपरिन को हटा दें। इसके बाद, ऊतकों को निकालना शुरू करने के लिए, पेरिटोनियल गुहा को खोलने के लिए माउस की पूंछ की ओर त्वचा और पेरिटोनियल झिल्ली को काट दें। सबसे पहले, माउस के प्रत्येक तरफ से इंगुइनल एडीपोज टिशू पैड निकालें।नोट: इस प्रक्रिया को ध्यान से पढ़ें: परिणामों में वसा ऊतक सेलुलर मेकअप को तिरछा करने से बचने के लिए प्रत्येक डिपो से इंगुइनल लिम्फ नोड निकालना सुनिश्चित करें।बल के दूसरे सेट का उपयोग करके, पेरिटोनियल झिल्ली को बल के एक सेट के साथ पकड़ें और त्वचा के किनारे को उस तरफ की झिल्ली के ऊपर अन्य बल के साथ रखें। इन परतों को एक दूसरे से अलग करने के लिए धीरे से त्वचा को पेरिटोनियल झिल्ली से दूर खींचें। त्वचा के साथ इंगुइनल वसा ऊतक डिपो की तलाश करें। वसा डिपो तक बेहतर पहुंच के लिए त्वचा के बाहरी किनारे को पिन करें। निष्कर्षण से पहले, वसा डिपो के केंद्र में इंगुइनल लिम्फ नोड का पता लगाएं और आवश्यकतानुसार बल और कैंची का उपयोग करके इसे हटा दें।नोट: यदि संभव हो, तो तीन बड़ी धमनियों का पता लगाएं जो डिपो के बाहरी किनारों से केंद्र की ओर चलती हैं। लिम्फ नोड आसपास स्थित है जहां ये धमनियां मिलती हैं। लिम्फ नोड को हटाने के बाद, सावधानीपूर्वक पिन किए गए बिंदु के पास वसा डिपो के अंत को बल के साथ पकड़ें और वसा ऊतक और त्वचा के बीच संयोजी झिल्ली पर छोटे कट बनाना शुरू करें। झिल्ली तक बेहतर पहुंच बनाने के लिए कट बनाते समय वसा ऊतक को त्वचा से दूर उठाएं और सुनिश्चित करें कि पूरे डिपो को निकाला जाए। फसल के शेष के दौरान ऊतक को व्यवहार्य रखने के लिए बर्फ पर एचईपीईएस बफर के साथ एक तैयार पॉलीथीन शीशी में वसा डिपो रखें। दोनों डिपो को निकालने के लिए माउस के दूसरी तरफ इस प्रक्रिया को दोहराएं। डिपो को या तो एक साथ या अलग से पचाया और संसाधित किया जा सकता है। यदि प्रत्येक डिपो को अलग से संसाधित किया जाना है, तो अधिक ट्यूब तैयार किए जाने चाहिए। इसके बाद, पेरिटोनियल गुहा के पुच्छल छोर से एपिडीडिमल एडीपोज डिपो निकालें। बल का उपयोग करके, माउस के पृष्ठीय छोर से पहले एपिडीडिमल एडीपोज डिपो को धीरे से खींचें और इस डिपो से जुड़े एपिडीडिमिस और वास डेफरेंस का पता लगाएं।नोट: दो एपिडीडिमल एडीपोज डिपो हैं: प्रत्येक एपिडीडिमिस और वास डेफेरेंस से जुड़ा एक।वसा को इन अन्य ऊतकों से अलग करने के लिए वसा डिपो और एपिडीडिमिस और वास के बीच सावधानीपूर्वक काट लें। फसल के शेष के दौरान ऊतक को व्यवहार्य रखने के लिए बर्फ पर एचईपीईएस बफर के साथ पॉलीथीन शीशी में वसा डिपो रखें। अंत में, प्लीहा निकालें, जो डायाफ्राम के पास पेट के बाईं ओर पाया जाता है। बल का उपयोग करके, प्लीहा को उजागर करने के लिए धीरे से पेट को पेरिटोनियल गुहा के केंद्र की ओर खींचें।धीरे से प्लीहा के एक छोर को पकड़ें और इसे पेट से थोड़ा दूर खींचें। प्लीहा और उसके आसन्न ऊतक के बीच की झिल्ली को तब तक काटें जब तक कि अंग अलग न हो जाए। एचईपीईएस बफर के साथ तैयार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्लीहा रखें और बर्फ पर स्टोर करें। अगले माउस से ऊतकों को संसाधित करने या ऊतकों की कटाई से पहले, शव और किसी भी गंदे पेपर तौलिए या पैड को फेंक दें। उपकरणों को भी मिटा दें।नोट: यदि कई चूहे हैं, तो अगले प्रसंस्करण चरण पर जाने से पहले प्रत्येक माउस के लिए इन फसल चरणों को दोहराएं। यदि एक नियंत्रण माउस / चूहों को शामिल किया गया है, तो किसी भी संदूषण से बचने के लिए लिपोसोम-उपचारित चूहों से पहले इनकी कटाई पर विचार करें। 6. ऊतकों की प्रक्रिया नोट: चूंकि वसा ऊतक में एक लंबी पाचन इनक्यूबेशन होती है, इसलिए पहले उस प्रक्रिया से शुरू करने और पाचन अवधि के दौरान रक्त और प्लीहा को संसाधित करने पर काम करने की सिफारिश की जाती है। सबसे पहले, वसा ऊतकों को कीमा और पचाएं। कैंची के एक या दो जोड़े का उपयोग करके, प्रत्येक पॉलीथीन शीशी में वसा ऊतक को तब तक कीमा करें जब तक कि ऊतक आकार में 0.5 मिमी से कम के छोटे टुकड़ों में न हो। यह अधिक कुशल पाचन के लिए अनुमति देता है।एक बार जब सभी शीशियों में ऊतक ों को काट दिया जाता है, तो प्रत्येक शीशी में 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस बफर का 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। शीशियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें। 30 से 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।नोट: यदि वसा ऊतक विशेष रूप से बड़े हैं, तो एचईपीईएस बफर के एक और 0.5 एमएल से 1.5 एमएल और शीशी (ओं) में कोलेजनेस बफर की समान मात्रा जोड़ने पर विचार करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ऊतक पूरी तरह से जलमग्न हैं और पर्याप्त एंजाइम मौजूद है। पाचन में कोलेजनेस टाइप 1 की अंतिम एकाग्रता अंतिम समाधान की मात्रा की परवाह किए बिना 1 मिलीग्राम / एमएल होनी चाहिए। इसके अलावा, यदि एक हिलने वाला इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है, तो नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में रखा जा सकता है। पाचन को मिलाने और पुन: निलंबित करने के लिए हर 5 मिनट में नमूनों को धीरे से हिलाएं। 30 मिनट पर नमूने की जांच करें। नमूने को ऊपर और नीचे पाइप करने के लिए 1 एमएल पाइप का उपयोग करें। यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी आसान पाइपिंग के लिए बहुत बड़े हैं, तो अतिरिक्त 15 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेटर में वापस करें। एक बार जब नमूने पूरी तरह से पच जाते हैं, तो एकल-सेल निलंबन बनाए जाने के लिए नमूने को 10 बार ऊपर और नीचे करना जारी रखें।नोट: (वैकल्पिक) 30 मिनट पर नमूने की जांच करें। नमूने को ऊपर और नीचे करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी आसान पाइपिंग के लिए बहुत बड़े हैं, तो अतिरिक्त 15 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेटर में वापस करें। सेल सस्पेंशन को 70 μm फ़िल्टर के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में डालें। शीशी को धोने के लिए खाली पाचन शीशी में 5 मिलीलीटर एफएसीएस बफर जोड़ें। सेल सस्पेंशन में जोड़ने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से इस वॉश बफर को स्थानांतरित करें। बर्फ पर नमूने स्टोर करें जबकि अन्य संसाधित किए जा रहे हैं। एक बार सभी नमूने फ़िल्टर हो जाने के बाद, उन्हें 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 °C पर स्पिन करें। एस्पिरेशन द्वारा एडिपोसाइट्स सुपरनैटेंट को हटा दें और फिर स्ट्रोमल-वैस्कुलर फ्रैक्शन (एसवीएफ) पेलेट को छोड़ने की आकांक्षा से एडिपोसाइट्स सुपरनैटेंट और पेलेट के बीच इन्फ्रानैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें। इस गोली को 1 एमएल एफएसीएस बफर में फिर से निलंबित करें और एक साफ 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि वांछित या आवश्यक हो तो एलिकोट कोशिकाएं। बर्फ पर रखें जब तक कि सभी नमूने फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए तैयार न हों।नोट: यदि पचाए गए वसा डिपो बड़े थे, तो प्रवाह साइटोमेट्रिक धुंधला और विश्लेषण के लिए केवल 50% या 25% नमूने का उपयोग करने पर विचार करें। इसके अतिरिक्त, यदि फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (तालिका 1) के लिए किसी भी प्रतिदीप्ति-माइनस-वन (एफएमओ) नियंत्रण या अतिरिक्त नियंत्रण की आवश्यकता है, तो प्रसंस्करण के लिए एक अलग ट्यूब में अतिरिक्त नमूने को एलिकोट करना सुनिश्चित करें। एफएमओ का उपयोग प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले अन्यथा-पूर्ण पैनल के भीतर एक व्यक्तिगत फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए नकारात्मक और सकारात्मक संकेत के बीच अंतर करने के लिए किया जाता है। दूसरा, रक्त को संसाधित करें।50 μL रक्त को 15-mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। एकल-सेल निलंबन तक पहुंचने के लिए प्रत्येक ट्यूब में एकेसी लाइसिस बफर के 1 एमएल जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करें। प्रत्येक ट्यूब में अतिरिक्त 4 एमएल एकेसी लाइसिस बफर जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यदि एक शेकर या रोटेटर उपलब्ध है, तो ट्यूब कैप को कसकर सील करें और मिश्रण को बढ़ाने के लिए ट्यूबों को इनमें से एक पर रखें। लाइसिस प्रक्रिया को बुझाने के लिए 5 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली की जांच करें। यदि यह अभी भी काफी लाल है, तो लाइसिस प्रक्रिया को दोहराएं। अन्यथा, एफएसीएस बफर के 1 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें और एक साफ 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ पर रखें जब तक कि सभी नमूने फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए तैयार न हों। अंत में, प्लीहा को संसाधित करें। प्लीहा को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर 70 μm फ़िल्टर पर स्थानांतरित करें। एफएसीएस बफर के 1 एमएल के साथ ऊतक को धोएं और फिर 1 एमएल सिरिंज के प्लंजर छोर का उपयोग करके फिल्टर के माध्यम से प्लीहा को मैश करें। मैशिंग प्रक्रिया के दौरान, अधिक एफएसीएस बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में धो लें। शंक्वाकार ट्यूब में अंतिम मात्रा 10 एमएल होनी चाहिए।कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर घुमाएं। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और एकेसी लाइसिस बफर के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। एकेसी लाइसिस बफर का एक अतिरिक्त 4 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लाइसिस प्रक्रिया को बुझाने के लिए 5 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर नमूने स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और एफएसीएस बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। निलंबन को एक दूसरे, साफ 70 μm फ़िल्टर के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। मूल ट्यूब को धोने के लिए 4 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और 5 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए फिल्टर के माध्यम से बफर को स्थानांतरित करें। सेल सस्पेंशन के 50 μL को एक साफ 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें जब तक कि सभी नमूने फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए तैयार न हों। यदि अधिक वांछित या आवश्यक हैं तो अतिरिक्त एलिकोट को ट्यूबों में स्थानांतरित किया जा सकता है।नोट: स्प्लेनोसाइट्स जीवित / मृत एकल दाग के लिए उपयोग करने के लिए उत्कृष्ट कोशिकाएं हैं। इस नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त एलिकोट स्थानांतरित करने पर विचार करें। 7. फ्लो साइटोमेट्री के लिए ऊतकों से दाग कोशिकाएं 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 °C पर एलिकोट नमूने को स्पिन करें। एफसी ब्लॉक (पतला) के 50 μL में सतह पर तैरनेवाला और पुन: तैरनेवाला नमूने निकालें (तालिका 2)। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक नमूने में 2x एंटीबॉडी मिश्रण (तालिका 3) के 50 μL जोड़ें। 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेने दें।नोट: किसी भी एकल दाग को इस एंटीबॉडी मिश्रण से दाग नहीं दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यदि एफएमओ का उपयोग किया जाना है, तो एफएमओ एंटीबॉडी मिश्रण अलग से तैयार किया जाना चाहिए। 1 एमएल पीबीएस के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 °C पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और व्यवहार्यता दाग के 200 μL में नमूने को पुन: निलंबित करें (तालिका 3)। 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेने दें।नोट: इस चरण के दौरान जीवित / मृत एकल दाग के लिए अलग रखी गई कोशिकाओं को दागना न भूलें। 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। नमूने को ठीक करने के लिए 50 μL निर्धारण माध्यम (अभिकर्मक ए) में सुपरनैटेंट और रिस्पेंशन नमूने (जीवित / मृत एकल दाग को छोड़कर) निकालें। 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।2% पीएफए के 100 μL में जीवित / मृत एकल दाग को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूना धोएं और 5 मिनट के लिए 800 x जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। एफएसीएस बफर के 250 से 500 μL में सतह पर तैरनेवाला और फिर से तैरनेवाला नमूने निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि नमूने प्रवाह साइटोमीटर पर नहीं चलाए जा सकते। 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 800 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला को निकालें और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के लिए 50 μL परमेबिलाइजेशन माध्यम (अभिकर्मक बी) और एंटीबॉडी / 20 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। नमूने को 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ धोएं और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 800 x g पर स्पिन करें। सुपरनैटेंट को हटा दें और 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 100 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 800 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और एफएसीएस बफर के 250 से 500 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि नमूने प्रवाह साइटोमीटर पर नहीं चलाए जा सकते।