Målet med detta protokoll är att syntetisera fluorescerande märkta liposomer och använda flödescytometri för att identifiera in vivo-lokalisering av liposomer på cellulär nivå.
Det finns ett växande intresse för att använda liposomer för att leverera föreningar in vivo, särskilt för riktade behandlingsmetoder. Beroende på liposomformuleringen kan liposomer företrädesvis tas upp av olika celltyper i kroppen. Detta kan påverka effekten av den terapeutiska partikeln eftersom progressionen av olika sjukdomar är vävnads- och celltypspecifik. I detta protokoll presenterar vi en metod för att syntetisera och fluorescerande märka liposomer med DSPC, kolesterol och PEG-2000 DSPE och lipidfärgämnet DiD som en fluorescerande etikett. Detta protokoll presenterar också ett tillvägagångssätt för att leverera liposomer in vivo och bedöma cellspecifikt upptag av liposomer med hjälp av flödescytometri. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bestämma vilka typer av celler som tar upp liposomer och kvantifiera fördelningen och andelen liposomupptag över celltyper och vävnader. Även om de inte nämns i detta protokoll, kommer ytterligare analyser såsom immunofluorescens och encellsfluorescensavbildning på en cytometer att stärka eventuella fynd eller slutsatser som görs eftersom de möjliggör bedömning av intracellulär färgning. Protokoll kan också behöva anpassas beroende på vävnaden / vävnaderna av intresse.
Eftersom intresset för att utveckla terapier som använder nanopartiklar läkemedelsleverans växer, måste metoderna för att förbereda och bedöma partikelfördelning och upptag fortsätta att utvecklas, expandera och vara tillgängliga för forskarsamhället 1,2. Detta protokoll utvecklades för att bedöma de exakta celltyperna som tog upp liposomer in vivo efter en behandling med DiD-märkta liposomer laddade med tesaglitazar, en peroxisomproliferatoraktiverad receptor (PPAR)-α/γ-agonist 3,4. I dessa studier kunde vi bedöma vilka celltyper som påverkades direkt av liposomal tesaglitazarbehandling, effekten av att rikta in sig på delar och generera hypoteser för att förklara de behandlingsresultat vi observerade. Vidare tyder etablerade biologiska funktioner i en mängd olika celltyper på att fagocytiska celler såsom makrofager, dendritiska celler och leverspecifika Kupffer-celler tar upp de flesta liposomerna 5,6,7. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att icke-klassiska fagocyter också kan ta upp liposomer 3,4.
Detta protokoll presenterar en optimerad metod för att solubilisera tesaglitazar, förbereda liposomer genom omvänd fasindunstning och använda kalciumacetat som ett lockmedel för fjärrladdning av läkemedel. De metoder som presenteras är tillgängliga för många laboratorier och saknar svårinförskaffade material och steg som kräver höga temperaturer. Protokollet producerar liposomer av storlekar som är optimala för ökad cirkulation in vivo8. Dessutom, som sammanfattats av Su et al., har hittills metoder för att utvärdera liposomdistribution in vivo och vävnadsupptag studerats och testats på djupet9. Positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRT) och fluorescensmolekylär tomografi (FMT) metoder används för att kvantifiera vävnadsspecifik biodistribution och upptag 9,10,11. Även om dessa metoder har optimerats för att maximera detektion in vivo, saknar de fortfarande förmågan att kvantifiera liposomupptag in vivo vid cellulär upplösning. Protokollet som presenteras här syftar till att uppnå detta behov genom användning av flödescytometri. Slutligen, för detta protokoll, minskades cellulärt upptag till några vävnader inklusive fettvävnad. Det finns en växande mängd litteratur som undersöker potentialen för användning av nanopartiklar för att leverera terapier i inställningen av fetma, dysmetabolism och inflammation 12,13,14,15,16,17. Som sådan kände vi att det var viktigt att dela ett protokoll med effektiva metoder för bearbetning och analys av fettvävnad – en av vävnaderna som spelar en viktig roll i dessa patologier.
Här beskriver vi ett tredelat protokoll för att (i) förbereda liposomer som är märkta med ett fluorescerande lipidfärgämne och laddade med en antidiabetisk förening, tesaglitazar, (ii) administrera liposomer till en mus via retroorbital injektion, och (iii) skörda, bearbeta och fläcka vävnader för att detektera liposomupptag på cellulär nivå genom flödescytometri. Detta protokoll granskar beredning av cirka 150 μm liposomer och bedömning av upptag i fett, blod och mjälte. Liposompreparatet är skalbart, utförs mestadels vid rumstemperatur och använder omvänd fasavdunstning för att maximera läkemedelsbelastning och avlägsnande av organiska lösningsmedel. Med hjälp av detta protokoll kan upp till 2 mg / ml tesaglitazarkoncentration uppnås i det renade liposomprovet. De beredda liposomerna kan förvaras i HEPES-buffert vid 4 °C i över ett år. Enligt vår erfarenhet visade de minimal variation av genomsnittlig partikelstorlek. Under 10% av läkemedelsinnehållsförlusten visades spektrofotometriskt, efter ultrafiltreringsseparation av liposomer från externt läkemedel med ett 10 kDa centrifugalfilter.
Under liposomberedning finns det några kritiska steg och faktorer att tänka på. För det första är ordningen på protokollstegen viktig och måste följas. För det andra måste pH-värdet i den lösning som används vid påfyllning av tesaglitazar hållas vid 7,4 för att maximera lösligheten och effektiv belastning. För det tredje säkerställer korrekt montering av utrustning och filter att utgången från varje steg är av rätt storlek och renhet. Till exempel, om 100- och 200-nm-filter inte monteras ordentligt, kan en mer heterogen och felaktigt dimensionerad sats liposomer resultera. För det fjärde behövs fullständigt avlägsnande av Ca-acetat före läkemedelsladdning för att maximera överföringen av tesaglitazar till liposomerna. För att testa för fullständigt avlägsnande av Ca-acetat, använd höghastighetssedimentering för att avlägsna liposomerna och sedan mäta Ca-acetatnivåerna i den icke-liposomala lösningen. För det femte är det viktigt att väga och registrera massan av alla material som läggs till liposompreparatet vid varje steg. Detta säkerställer att lämpliga koncentrationer kan beräknas och nödvändiga materialförhållanden bibehålls. Slutligen, om tekniken inte utförs korrekt, kan det finnas en oönskad nivå av heterogenitet. Det är viktigt att noggrant kontrollera denna parameter med DLS och andra metoder som elektronmikroskopi. Om du vill förbättra homogeniteten bör du överväga att justera den valda filterstorleken eller stapla två filter.
Dessutom är det viktigt att kontroller och en antikroppspanel för flödescytometri planeras och optimeras innan detta protokoll genomförs i sin helhet (tabell 1, tabell 3). Antikroppar bör testas för att säkerställa att lämpliga koncentrationer används för färgning och att överlappningen mellan fluoroforer är minimal. Excitationen och utsläppet av färgämnet som används under liposomberedning måste också beaktas i panelplaneringen. I våra resultat använde vi DiD, som har en liknande excitation och emission som fluoroforer som Allophycocyanin (APC) och AlexaFluor 647. Således valde vi inte antikroppar konjugerade till dessa fluoroforer i vår antikroppspanel. Dessutom ingår inte isotypkontroller i detta protokoll. Detta beror på att antikropparna som valts för detta protokoll är välvaliderade, kommersiellt tillgängliga antikroppar. Men om du är intresserad av att använda en antikropp som inte har optimerats tidigare, överväg att testa antikroppen mot en isotypkontroll på vävnaderna av intresse innan du utför hela experimentet.
Medan detta protokoll visar hur man extraherar och bearbetar blod, mjälte, inguinal fett och bitestikelfettvävnad från musen efter behandling, kan detta allmänna tillvägagångssätt tillämpas på andra vävnader. Beroende på vävnaden av intresse kan bearbetnings- och matsmältningsprotokoll behöva ändras som publiceras för följande vävnader: lunga21, lever22, bukhålan 3, benmärg3,23, hjärna 24.
En viktig begränsning med denna metod att beakta är att upptaget endast kan bedömas vid en tidpunkt per djur. Det kan därför vara fördelaktigt att koppla detta protokoll till andra icke-invasiva avbildningstekniker eller planera därefter för att säkerställa tillräckliga resurser för att genomföra bedömningen. Tidpunkten för cellulärt upptag och cellulär omsättning är viktiga faktorer att tänka på: liposomer kommer att cirkulera i hela kroppen under de första 24 timmarna och beroende på livslängden hos cellerna som tar upp liposomer eller hur de svarar på upptag kan celldöd eller ytterligare fagocytos uppstå. Vår tidigare studie visade förändringar i populationskarakteristika för DiD + -populationer vid olika tidpunkter3. Av den anledningen är det viktigt att utvärdera upptaget vid tidigare tidpunkter eller tidpunkter som är mest relevanta för biologin av mekanismen av intresse. Dessutom, medan kvantifiering av cellupptag i hela vävnaden kan utföras med detta protokoll, kan flödescytometri inte avslöja vävnadslokalisering. Att koppla detta tillvägagångssätt med histologiska metoder kan hjälpa till att hantera denna begränsning.
I allmänhet kompletterar detta protokoll befintlig metodik såsom histologi och helkroppsfluorescensavbildning. Med de fortsatta framstegen inom flödescytometriverktyg och metoder kommer utvecklingen av större paneler till mer och mer specifika cellpopulationer att bli möjlig. Vi föreslår att detta protokoll används utöver de ovan nämnda metoderna eftersom detta kommer att förbättra utvärderingen av cellulärt upptag och också ge möjlighet att validera de resultat som observerats med flödescytometri. Till exempel bör det konstateras att en majoritet av partiklarna i fettvävnad togs upp av makrofager genom flödescytometri. Immunofluorescens av ytterligare en alikvot av samma fettvävnad kan sparas, fixeras, snittas och färgas för makrofagmarkörer för att verifiera att celltypen verkligen tar upp liposomer. Detta tillvägagångssätt bör lägga till noggrannhet i nanopartikelbiodistributionsanalyser som utförs: validera cellspecifik inriktning, kvantifiera cellulärt upptag, identifiera off-target upptag och förhoppningsvis tillhandahålla information för att generera mekanistiska hypoteser för observerade terapeutiska resultat. Detta protokoll kan också anpassas för framtida studier med olika liposomer, undersöka upptag i andra vävnader och testa nya föreningar vid fetma och dysmetabolism eller någon annan sjukdom där nanopartikelleverans är ett genomförbart terapeutiskt alternativ.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Michael Solga och resten av Flow Cytometry Core-personalen för att ha tillhandahållit flödescytometriutbildning och tjänster. Författarna vill också erkänna Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye och Prasad Srikakulapu för deras hjälp med liposomberedning (SSKD, DKB), vävnadsskördar (MAM, JCG) och flödescytometrifärgning och provförvärv (AU, PS, CM). Detta arbete stöddes av bidrag från AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 och R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 och T32 HL007284.
1-mL syringe | BD | 309659 | |
10-mL syringe | BD | 302995 | |
25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
Sonicator | Misonix | XL2020 | |
T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |