여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.
정량적 라이브 세포 이미징의 현대 접근법은 통계 및 계산 모델링을 사용하여 생물학적 과정을 분류하고 비교할 수 있게 함으로써 세포 생물학을 탐구하는 데 필수적인 도구가 되었습니다. 세포 배양 모형 시스템은 높은 콘텐츠 화상 진찰을 위해 중대하더라도, 세포 형태학의 높은 처리량 연구 결과는 전 생체 권양이 살아있는 유기체 내의 세포에서 찾아낸 형태학적 복잡성을 재구성에 제한된다는 것을 건의합니다. 따라서, 손상되지 않은 유기체 내의 살아있는 세포를 이미지화하기 위해 확장 가능한 높은 처리량 모델 시스템이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 동시 동기 전폭 단계 동안 배아 Drosophila 멜라노가스터 발달의 다중 타임랩스 비디오를 획득하기 위해 고함량 이미지 분석기를 사용하는 프로토콜이다. 싱크로나이즈드 블라스트르름은 전통적으로 생물학적 사건을 이미징하기 위한 훌륭한 생체 내 모델로 작용해 왔습니다. 그러나, 정량적 및 고처리량 접근법을 위한 상당한 수의 실험 복제를 얻는 것은 실험반복당 단일 배아의 이미징에 의해 노동 집약적이고 제한되었다. 여기에 제시된 화상 진찰 및 미세 주입 접근은 고함량 화상 진찰 시스템, 또는 자동화된 다중점 취득을 할 수 있는 어떤 반전된 현미경든지 에 맞게 적응하는 방법입니다. 이 접근은 단 하나 화상 진찰 세션 안에, 원하는 취득 요인에 따라서 6-12 태아의 동시 취득을 가능하게 합니다.
지난 30년 동안, 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 화상 진찰 기술 및 분자 프로브에 있는 발전은 세포의 복잡성 그리고 내부 작동의 우리의 이해를 발전시켰습니다. 기술의 이 진입로와 함께 높은 처리량 이미징 데이터의 수집을 위한 ex vivo 세포 배양 모델의 사용에 더 큰 의존도가 있습니다. 세포 배양 모델은 미세 유체 시스템을 통한 미세 환경 제어 및 여러 세포를 동시에 이미지화하는 기능을 포함하여 몇 가지 장점을 제공하여 고처리량 스크리닝1,2에필요한 정량적 접근 방식을 사용할 수 있게 한다. 그러나, 세포 형태학 및 그 규제3,4,5에혼동효과를 내는 2차원 유리 또는 플라스틱 표면과 같은 형태학적 연구의 맥락에서 세포 배양 모델과 관련된 유의한 단점도있다. 이러한 효과 세포 형태를 조절 하는 생물학적 프로세스의 연구에 관해서 거짓 또는 오해의 소지가 데이터를 제공할 수 있습니다.
대안은 그대로 유기체6의맥락에서 세포 형태를 연구하는 것이었지만, 소수의 적합한 손상 유기체는 이미징을 통해 전체 유기체를 살아 있게 하는 데 어려움을 겪고 큰 다세포 유기체 내부의 이미징과 관련된 어려움으로 인해 높은 처리량 정량적 라이브 세포 이미징을 용이하게 합니다. 그 결과, 그대로 유기체에 있는 세포 생물학 연구 결과는 일반적으로 견본 크기를 크게 제한하는 시간 지남에 단 하나 유기체를 관찰에 집중했습니다. 또한, 이러한 원-동물-시간 제한은 라이브 이미징을 화면 형태로 사용하기 어렵고 비용이 많이 들게 하고 샘플 수가 일반적으로 너무 작기 때문에 정량적 분석 도구를 적용하는 기능을 제한합니다. 따라서, 고함량 기반 정량적 접근법에 사용될 수 있는 다세포 모델 유기체에 대한 필요성이 발생한다.
이 프로토콜은 플레이트 기반 고함량 이미징을 위해 Drosophila 배아를 조정하여 정량 적 분석을 위한 충분한 크기의 실험 샘플 크기를 생성합니다. 드로소필라 멜라노가스터는 일반적으로 첫 번째 모델 유기체로 알려져 있다. Drosophila를 이용한 연구는 유전 정보의 전송, 세포 신호 경로의 식별 및 배아 발달의 유전 적 요구 사항을 포함하여 세포 및 분자 생물학에 있는 돌파구로 이끌어 냈습니다7,8,9. 또한, 드로소필라 배아는 세포 분부10,11,12동안 생체 내 마이크로투룰 역학을 탐구하는 데 사용되어 왔다. 작은 분자와 분자 프로브를 전달하기 위하여 미세 주입의 사용은 생체13,14에서세포 프로세스를 탐구하기 위한 Drosophila 배아 발달을 특히 강력하게 만드는 측두광을 제공합니다. 그러나, 전통적인 화상 진찰 접근으로 실험 반복의 상당수를 생성하는 것은 극단적으로 노동 집약적이며 고처리량 화상 진찰 스크린 및 정량 분석에 있는 한정된 사용이 있습니다. 우리의 접근 방식은 일반적으로 단하나 세포 분석을 위해 예약된 고함량 분석기를 사용하고 초기 Drosophila embryo의 syncytium에서 생체 내 이미징 분석에 적응합니다.
이 프로토콜은 수집, 단계 및 마이크로 주입 Drosophila 배아를 수집하는 데 사용되었다( ER) 미토시스 동안 내도성 망상 (ER)의 형태변화를 구동 하는 메커니즘을 탐구하는 15. 많은 연구가 세포 주기 동안 ER의 동적 특성을 설명했지만16,17,18,19,ER 형태에 걸쳐 여러 동요의 효과를 비교하기 어려웠다. 세포 분열에 걸쳐 ER 형태학의 변화를 구동하는 구성 요소를 식별하기 위해,이 프로토콜에 나열된 방법은 초기 Drosophila 배아에서 피질 싱크량 분열을 사용하여 미토알 ER 재구성에 미세 tubules 및 기타 사이토셀레탈 인자의 역할을 조사하는 데 사용되었다. 함께 촬영, Drosophila 지역 사회 내에서 유전 적 혼란의 가용성, 개발 하는 동안 정확한 시간에 약물과 분자 프로브를 마이크로 주입 하는 능력, 그리고 Drosophila와 함께 작업의 저렴 한 비용 높은 처리량 이미지 기반 스크리닝에 매우 순종. 여기에 설명된 방법은 Drosophila 배아(20)를사용하여 생체 내에서 다양한 세포 및 발달 과정을 연구할 수 있다. 특히, 이 프로토콜은 Drosophila 태아 피질의 100 미크론 이내및 연장된 기간 에 걸쳐 생기는 생물학 사건을 공부하기 위하여 잘 적응됩니다.
여기에서 기술된 프로토콜은 Drosophila 배아 발달에 있는 각종 단계에서 생물학 사건을 공부하기 위한 높게 다재다능하고 쉽게 적응합니다. 이 프로토콜은 오랜 기간 동안 발생하는 생물학적 과정을 연구하는 데 적합합니다. 예를 들어, 세포화29,30 또는 Drosophila31에서이종학로마티닌 도메인의 형성에 대한연구는,32이러한 프로세스가 오랜 기간 동안 발생하기 때문에 이 프로토콜에 설명된 방법을 활용하는 혜택을 누릴 수 있다. 또한, 시료 크기는 확대를 감소시켜 확대하여 확대하여 동기화부(33) 또는 위화기간(34)의타이밍과 같은 광학 적 분해능이 덜 필요한 질문을 연구할 수 있다. 마찬가지로, 20배의 목적은 두 개의 배아가 하나의 이미징 평면 내에서 촬영될 수 있게 합니다. 이 프로토콜의 방법은 배아 발달을 정량적 분석을 위한 모델 시스템으로 서생물학적 질문을 하는 동적 플랫폼을 제공합니다.
이 프로토콜에는 3개의 중요한 단계가 있습니다. 50%의 표백제에서 후불양은 배아가 5배(2.3.4)로 격렬하게 헹구고 건조하는 것이 필수적이다. 이 단계는 남은 작은 초리온 조각을 제거합니다. 남은 초리온은 배아를 이미징 할 때 시야를 방해할 것입니다. 유리 커버슬립(3.5)에 배아를 장착할 때, 배아를 균일한 압력으로 접착제에 눌러야 한다. 이것은 같은 z 평면에 배아를 배치합니다. 미세 주입 바늘을 열 면, 바늘의 유량을 조정 하기 위해 플런저를 즉시 철회 하는 것이 중요 하다 또는 모든 주입을 잃게 됩니다.
우리의 연구는 두 가지 요인에 의해 제한되었다. 첫 번째 요소는 자동화된 세분화 프로세스가 없는 것이었습니다. 그러나 MATLAB을 사용하여 수동 세분화 스크립트를 설계했습니다. 유전적으로 인코딩된 스핀들 마커를 사용하면 이 과정이 자동화될 수 있습니다. 미래에 우리는 CNN-RFP21,Rtln1-GFP 및 CNN-RFP를 생산하고 싶습니다. ReepB-GFP 형질 화선은 자동화된 스핀들 세분화를 가능하게 합니다. MATLAB 스크립트 및 분석 파이프라인에 대한 자세한 내용은 Diaz 외15의보충 자료를 참조하십시오. 둘째, 우리는 또한 35s의 우리의 취득 간격에 의해 제한되었습니다, 이는 우리가 단지 6 개의 배아를 동시에 이미지할 수 있었습니다. 더 긴 획득 간격을 통해 더 많은 배아를 동시에 이미지화할 수 있습니다. 약물 전달 처리량은 투과 단계로 미세 주입을 대체하여 증가 할 수 있지만, 우리는 우리의 샘플 크기가 이미 취득 간격에 의해 제한되었기 때문에 이것이 불필요하다는 것을 발견했습니다.
이 프로토콜은 Drosophila 배아 발달을 이미지하기 위하여 이용되었지만, 전반적인 접근은 C. elegans,성게 및 제노푸스와같은 그밖 다세포 모형 시스템에서 배아 발달을 공부하기 위한 적응성이 있습니다. 배아는 수집 또는 수정을 통해 쉽게 동기화되기 때문에 정량 분석에 매우 유용합니다. 또한 배아는 시야에서 이동하거나 수영하지 않아 간단한 멀티포인트 획득 가능한 소프트웨어를 사용하여 정량적 분석을 위한 여러 시간 경과 비디오를 생성할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 높은 함량 분석기를 사용했지만, 멀티 포인트 획득 할 수있는 모든 반전 현미경 시스템은 본원에서 언급 된 방법과 결합 될 수있다.
유사한 결과는 반전된 공초점 현미경을 할 수 있는 멀티포인트 획득을 사용하여 얻을 수 있다; 그러나, 높은 함량 분석기의 장점은 샘플 크기를 증가하여 시간에 덜 해결이 필요한 질문을 연구함에 따라 나타납니다. 높은 함량 분석기를 사용하는 것이 명백한 장점은 기존 시스템의 슬라이드 1개에 비해 4개의 개별 슬라이드를 동시에 이미지화할 수 있다는 점입니다. 각 슬라이드에 4개의 슬라이드와 40개의 배아의 전체 세트를 가진, 160개의 태아는 취득 간격이 프레임 사이 적어도 15 분 인 한, 몇 시간 동안 심을 수 있습니다. 고함량 분석기를 사용하는 또 다른 중요한 장점은 형광 강도 기반 측정에 필요한 외부 광원으로부터 샘플이 완전히 밀봉된다는 것입니다. 마지막으로, 연구에 사용되는 고함량 분석기는 5.5메가픽셀 CMOS 카메라를 탑재하여 60배율의 관대한 221.87 μm 시야를 제공합니다. 이 더 큰 시야를 통해 우리는 획득 지점당 배아의 절반을 이미지화할 수 있었습니다.
The authors have nothing to disclose.
UD, WFM 및 BR은 국가 과학 재단 (NSF) 과학 기술 센터인 셀룰러 건설 센터가 보조금 계약에 따라 DBI-1548297의 지원을 받습니다. BR은 NSF 커리어 어워드인 1553695를 통해 지원됩니다.
10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
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Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
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Culture Well Silicone Sheet Material – 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
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Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
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Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
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Silica gel beads, desiccant ~ 2 – 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
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Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
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Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
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Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |