ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ 胚をマイクロインジェクトし、同時に画像化するプロトコルです。
定量的な生細胞イメージングにおける最新のアプローチは、生物学的プロセスを分類して比較するために統計と計算モデリングを使用することによって、細胞生物学を探求するための不可欠なツールとなっています。細胞培養モデルシステムは高含有イメージングに最適ですが、細胞形態の高スループット研究は、生物内の細胞に見られる形態学的複雑さを再現する上で、ex vivo培養が限られていることを示唆しています。そのため、無傷の生物の中で生きている細胞をイメージするために、スケーラブルな高スループットモデルシステムが必要です。ここで説明する高コンテンツ画像分析装置を用いて、同期性芽胚期の胚性 ショウジョウバエメラノガスター 発生の複数のタイムラプスビデオを同時に取得するためのプロトコルを説明する。同期性ブラソデアルは、伝統的に生物学的事象をイメージングするための素晴らしいin vivoモデルとして機能してきました。しかし、定量的およびハイスループットアプローチのためのかなりの数の実験複製を得る作業は、実験反復ごとに単一の胚のイメージングによって、労力を要し、制限されている。ここで提示される高内容の画像化システム、または自動マルチポイント獲得が可能な任意の逆顕微鏡に合わせて画像化およびマイクロインジェクションアプローチを適応させる方法を提示する。このアプローチにより、単一のイメージングセッション内で、望ましい取得因子に応じて6~12個の胚を同時に取得できます。
過去30年間、生細胞イメージングのためのイメージング技術と分子プローブの進歩は、細胞の複雑さと内部の働きの理解を深めてきました。この技術の前進に伴うことは、高スループットイメージングデータを取得するためのex vivo細胞培養モデルの使用に大きく依存しています。細胞培養モデルは、マイクロ流体系を介した微小環境の制御、および複数の細胞を同時に画像化する能力を含むいくつかの利点を提供し、ハイスループットスクリーニング1,2に必要な定量的アプローチの使用を可能にする。しかし、2次元ガラスやプラスチック表面など、細胞形態学的研究の文脈において、細胞培養モデルに関連する重大な欠点もあり、細胞形態とその調節3、4、5に交容する効果を生み出す。これらの効果は、細胞形態を調節する生物学的プロセスの研究に関して、偽または誤解を招くデータを提供することができます。
別の方法は、無傷の生物6の文脈で細胞形態を研究することであったが、少数の適切な無傷の生物は、イメージングを通じて生物全体を生き続けるのが難しいため、高スループット定量的な生細胞イメージングを促進し、大きな多細胞生物の中でのイメージングに関連する課題を促進する。その結果、無傷の生物の細胞生物学的研究は、一般的に、サンプルサイズを大幅に制限する単一の生物を観察することに焦点を当てています。さらに、この一時の動物の制限は、ライブイメージングが困難で、画面の形で採用するのにコストがかかり、サンプルの数が一般的に少なすぎるため、定量分析ツールを適用する能力を制限します。したがって、高含有量的アプローチに使用できる多細胞モデル生物の必要性が生じる。
このプロトコルは、ショウジョウバエ胚をプレートベースの高含量イメージングに適応させ、定量分析に十分な大きさの実験サンプルサイズを生成します。ショウジョウバエメラノガスターは、一般に最初のモデル生物として知られています。ショウジョウバエを用いた研究は、遺伝情報の伝達、細胞シグナル伝達経路の同定、および胚発生7、8、9の遺伝的要件を含む細胞および分子生物学におけるブレークスルーを導いた。さらに、ショウジョウバエ胚は、細胞分裂10、11、12の間に生体内微小管ダイナミクスを探索するために使用されてきた。微小分子および分子プローブを送達するためのマイクロインジェクションの使用は、ショウジョウバエ胚発生を生体内13,14で細胞プロセスを探査する上で特に強力な時間制御を提供する。しかし、従来のイメージングアプローチでかなりの数の実験反復を生成することは非常に労力がかかり、高スループットのイメージング画面や定量分析での使用が制限されています。我々のアプローチは、一般的に単一細胞分析のために予約された高含有分析器を利用し、初期のショウジョウバエembryoのシンジチウムにおける生体内イメージング解析に適応する。
このプロトコルは、ショウジョウバエ胚を収集、ステージ、およびマイクロインジェクトして、有糸分裂15の間にエンドプラスミクスレチクルム(ER)の形態変化を駆動するメカニズムを探索するために使用された。多くの研究は、細胞周期16、17、18、19の間にERの動的性質を概説しているが、ER形態に対する時間の経過に及ぼす複数の摂動の影響を比較することは困難であった。細胞分裂全体にわたってER形態の変化を促進する成分を同定するために、このプロトコルに記載されている方法は、ショウジョウバエ初期胚における皮質合分分裂を用いた有糸性ER再編成における微小管および他の細胞骨格因子の役割を調査するために使用された。一緒に言えば、ショウジョウバエコミュニティ内の遺伝的摂動の可用性、開発中の正確な時期に薬物および分子プローブをマイクロ注入する能力、およびショウジョウバエとの作業の安価なコストは、このアプローチを高スループット画像ベースのスクリーニングに非常に受け入れやすい。ここで説明する方法は、ショウジョウバエ胚20を用いて生体内での多種多様な細胞および発達過程を研究するために適用可能である。具体的には、このプロトコルは、ショウジョウバエ胚皮質の100ミクロン以内に長期間にわたって発生する生物学的事象を研究するために十分に適応される。
ここで説明するプロトコルは、ショウジョウバエ胚発生の様々な段階で生物学的事象を研究するための非常に汎用性が高く、容易に適応可能である。このプロトコルは、長期間にわたって発生する生物学的プロセスの研究に適しています。例えば、ショルバライゼーション29、30、またはショウジョウバエ31,32におけるヘテロクロマチンドメインの形成の研究は、これらのプロセスが長期間にわたって起こるので、このプロトコルに記載されている方法を利用することから利益を得ることができる。また、倍率を下げることでサンプルサイズを大きくすることができ、同期分割33間のタイミングや胃の持続時間34などの光学解像度を必要としない質問を研究することができる。 同様に、20倍の目的は、1つのイメージング平面内で2つの胚を画像化することを可能にする。このプロトコルの方法は、定量分析のためのモデルシステムとして胚発生を用いて生物学的な質問をする動的なプラットフォームを提供する。
このプロトコルには、3 つの重要な手順があります。50%漂白剤の後のデコールリオネーションは、胚を洗浄し、精力的に5回乾燥することが不可欠である(2.3.4)。このステップは、残った小さな絨毛を取り除きます。残った絨毛は、胚を画像化する際に視野を妨げる。胚をガラスカバースリップ(3.5)に取り付ける場合、胚を均一な圧力で接着剤に押し込むのが重要です。これにより、胚は同じz平面に配置されます。マイクロインジェクション針を切り開くとき、針の流量を調整するためにプランジャーをすぐに引き込むか、すべての注射剤を失うことが重要です。
我々の研究は2つの要因によって制限された。最初の要因は、自動セグメンテーションプロセスを持たないことでした。しかし、MATLABを使用して手動セグメンテーションスクリプトを設計しました。遺伝的にコードされたスピンドルマーカーを使用すると、このプロセスを自動化することができます。将来的には、CNN-RFP 21、Rtln1-GFP、CNN-RFPを生産したいと考えています。ReepB-GFP トランスジェニック ラインにより、スピンドルセグメンテーションを自動化できます。MATLAB スクリプトと分析パイプラインの詳細については、Diaz らの補足資料を参照してください。第二に、我々はまた、同時に6個の胚を画像化することができた35秒の取得間隔によって制限されました。より長い取得間隔は、私たちが同時により多くの胚をイメージすることができます。マイクロインジェクションをパーメレーションステップに置き換えることで薬剤送達スループットを高めることができますが、サンプルサイズはすでに取得間隔によって制限されているため、これは不要であることがわかりました。
このプロトコルは ショウジョウバエ胚 発生をイメージするために使用されたが、全体的なアプローチは 、C.エレガンス、ウニ、 ゼノプスなどの他の多細胞モデルシステムにおける胚発生を研究するために適応可能である。胚は、採取や受精によって容易に同期されるため、定量分析に非常に有用です。さらに、胚は視野から離れたり泳いだりすることはおかしくないため、単純なマルチポイント取得対応ソフトウェアを使用して定量分析のために複数のタイムラプスビデオを作成できます。我々は研究において高含有分析装置を用いたが、マルチポイント獲得が可能なあらゆる逆顕微鏡システムは、本明細書で言及される方法と対にすることができる。
同様の結果は、反転共焦点顕微鏡を使用して得ることができるマルチポイント取得を使用して得ることができます。しかし、高コンテンツ分析装置の利点は、サンプルサイズが増加し、時間の解像度が低い質問を研究する際に生じる。高コンテンツアナライザを使用する利点は、従来のシステムで 1 スライドと比較して、4 つのスライドを同時にイメージする機能です。各スライドに4枚のスライドと40個の胚のフルセットを使用すると、取得間隔がフレーム間に少なくとも15分である限り、160個の胚を数時間にわたって画像化することができます。高含有分析装置を使用するもう1つの重要な利点は、サンプルが蛍光強度ベースの測定に必要な外部光源から完全に遮断されることです。最後に、我々の研究で使用される高コンテンツ分析器は、60倍の倍率で寛大な221.87 μm視野を提供する5.5メガピクセルのCMOSカメラを備えています。この大きな視野は、取得ポイントごとに胚の半分を画像化することを可能にしました。
The authors have nothing to disclose.
UD、WFM、BRは、国立科学財団(NSF)科学技術センターであるセルラー建設センターが、助成金契約DBI-1548297の下で支援しています。BRはNSFキャリア賞、1553695を通じてもサポートされています。
10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
Culture Well Silicone Sheet Material – 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
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Silica gel beads, desiccant ~ 2 – 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
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Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |