يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.
وقد أصبحت الأساليب الحديثة في التصوير الحي للخلايا الكمية أداة أساسية لاستكشاف بيولوجيا الخلايا، من خلال تمكين استخدام الإحصاءات والنمذجة الحسابية لتصنيف العمليات البيولوجية ومقارنتها. على الرغم من أن أنظمة نموذج ثقافة الخلية كبيرة للتصوير عالي المحتوى ، فإن دراسات الإنتاجية العالية لمورفولوجيا الخلايا تشير إلى أن ثقافات الخلايا الحية السابقة محدودة في تلخيص التعقيد المورفولوجي الموجود في الخلايا داخل الكائنات الحية. على هذا النحو ، هناك حاجة لنظام نموذج عالي الإنتاجية قابلة للتطوير لصورة الخلايا الحية داخل كائن حي سليم. وصف هنا هو بروتوكول لاستخدام محلل صورة عالية المحتوى للحصول في وقت واحد متعددة الوقت الفاصل الفيديو من الجنينية Drosophila التنمية الميلانوغاستر خلال مرحلة blastoderm متزامن. وقد خدم البلاستدرم المتزامن تقليديا كنموذج كبير في الجسم الحي لتصوير الأحداث البيولوجية; ومع ذلك، فإن الحصول على عدد كبير من النسخ المتماثلة التجريبية للنهج الكمية والعالية الإنتاجية كان كثيف العمالة ومحدودًا من خلال تصوير جنين واحد لكل تكرار تجريبي. هنا هو طريقة لتكييف التصوير وmicroinjection النهج لتتناسب مع نظام التصوير ذات المحتوى العالي ، أو أي مجهر مقلوب قادرة على الحصول الآلي multipoint. يتيح هذا النهج الحصول المتزامن على 6-12 جنينًا، حسب عوامل الاكتساب المرغوبة، في جلسة تصوير واحدة.
على مدى السنوات ال 30 الماضية، تقدم التقدم في تقنيات التصوير والتحقيقات الجزيئية للتصوير بالخلايا الحية إلى الأمام فهمنا لتعقيد الخلية وعملها الداخلي. ويرافق هذا التقدم في التكنولوجيا هو زيادة الاعتماد على استخدام السابقين نماذج الخلايا الحية ثقافة للحصول على بيانات التصوير عالية الإنتاجية. توفر نماذج ثقافة الخلايا العديد من المزايا، بما في ذلك التحكم في البيئة الدقيقة من خلال أنظمة microfluidic، والقدرة على تصوير خلايا متعددة في وقت واحد، مما يتيح استخدام الأساليب الكمية اللازمة لفحص الإنتاجية العالية1،2. ومع ذلك ، هناك أيضا عيوب كبيرة مرتبطة بنماذج ثقافة الخلية في سياق الدراسات المورفولوجية ، مثل الزجاج ثنائي الأبعاد أو الأسطح البلاستيكية التي تنتج تأثيرات محيرة على مورفولوجيا الخلية وتنظيمها3،4،5. يمكن أن توفر هذه الآثار بيانات خاطئة أو مضللة فيما يتعلق بدراسة العمليات البيولوجية التي تنظم مورفولوجيا الخلايا.
على الرغم من أن البديل كان لدراسة مورفولوجيا خلوية في سياق كائن حي سليم6، فإن عدد قليل من الكائنات الحية السليمة المناسبة تسهل عالية الإنتاجية التصوير الخلايا الحية الكمية بسبب صعوبات في الحفاظ على الكائنات الحية بأكملها على قيد الحياة من خلال التصوير ، والتحديات المرتبطة بالتصوير داخل كائن حي كبير متعدد الخلايا. ونتيجة لذلك، ركزت الدراسات البيولوجية للخلايا في الكائنات الحية السليمة عموما على مراقبة كائن حي واحد مع مرور الوقت، مما يحد إلى حد كبير من حجم العينة. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الحد من الحيوانات الواحدة في الوقت الواحد يجعل التصوير الحي صعبًا ومكلفًا في استخدام الشاشة ويحد من القدرة على تطبيق أدوات التحليل الكمي نظرًا لأن عدد العينات صغير جدًا بشكل عام. وهكذا، تنشأ الحاجة إلى كائن حي نموذج متعدد الخلايا التي يمكن استخدامها للنهج الكمية ذات المحتوى العالي القائمة.
يكيف هذا البروتوكول جنين دروسوفيليا للتصوير عالي المحتوى القائم على الألواح لتوليد أحجام عينات تجريبية كبيرة بما يكفي للتحليل الكمي. Drosophila الميلانوغاستر المعروف باسم الكائن أول نموذج. وقد أدت البحوث باستخدام Drosophila إلى اختراقات في الخلايا والبيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك نقل المعلومات الوراثية ، وتحديد مسارات إشارات الخلايا ، والمتطلبات الوراثية للتنمية الجنينية7،8،9. وبالإضافة إلى ذلك، وقد استخدم الجنين Drosophila لاستكشاف في ديناميات ميكروتوبول في الجسم الحي خلال التقسيم الخلوي10،11،12. استخدام الحقن المجهرية لتقديم جزيئات صغيرة و تحقيقات الجزيئية يوفر التحكم الزمني الذي يجعل Drosophila تطوير الجنينية قوية بشكل خاص لتحري العمليات الخلوية في الجسم الحي13،14. ومع ذلك، فإن توليد عدد كبير من التكرارات التجريبية باستخدام نهج التصوير التقليدي هو عمل كثيف للغاية وله استخدام محدود في شاشات التصوير عالية الإنتاجية والتحليل الكمي. نهجنا يجعل استخدام محلل محتوى عالية محفوظة عادة لتحليل خلية واحدة ويتكيف في تحليل التصوير في الجسم الحي في syncytium من الدرسونو فيوقت مبكر ه mbryo.
تم استخدام هذا البروتوكول لجمع، مرحلة، وmicroinject الأجنة Drosophila لاستكشاف الآليات التي تدفع التغيرات المورفولوجية في إندوبلاسميك ريتيكولوم (ER) خلال الانقسام15. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد حددت الطبيعة الديناميكية لـ ER خلال دورة الخلية16،17،18،19، فقد كان من الصعب مقارنة آثار الانزعاجات المتعددة عبر الزمن على مورفولوجيا ER. لتحديد المكونات التي تدفع التغييرات في ER مورفولوجيا عبر انقسام الخلايا، واستخدمت الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول للتحقيق في دور microtubules وغيرها من العوامل الخلوية في إعادة تنظيم ER ميتوسيتيك باستخدام الانقسام المتزامن القشرية في الجنين الدروسوفيا في وقت مبكر. إذا ما أخذت معا، وتوافر الانزعاج الوراثي داخل المجتمع Drosophila، والقدرة على microinject المخدرات و التحقيقات الجزيئية في أوقات دقيقة أثناء التنمية، وتكلفة غير مكلفة للعمل مع Drosophila يجعل هذا النهج قابل جدا لفحص الصورة عالية الإنتاجية على أساس. الأساليب المذكورة هنا قابلة للتطبيق لدراسة مجموعة واسعة من العمليات الخلوية والتنموية في الجسم الحي باستخدام الجنين Drosophila 20. على وجه التحديد، هذا البروتوكول هو جيد التكيف لدراسة الأحداث البيولوجية التي تحدث على مدى فترة طويلة وضمن 100 ميكرون من قشرة الجنين دروسوفيليا.
البروتوكول الموصوف هنا متعدد الاستخدامات للغاية ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة الأحداث البيولوجية في مجموعة متنوعة من المراحل في التنمية الجنينية دروسوفيليا. وهذا البروتوكول مناسب تماما لدراسة العمليات البيولوجية التي تحدث على مدى فترات زمنية طويلة. على سبيل المثال، يمكن أن تستفيد دراسات الخلايا29،30 أو تشكيل مجالات هيتروكروومتين في Drosophila31،32 من استخدام الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول لأن هذه العمليات تحدث على مدى فترة طويلة من الزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة حجم العينة عن طريق تقليل التكبير لدراسة الأسئلة التي تتطلب أقل دقة البصرية، مثل توقيت بين الانقساماتالمتزامنة 33 أو مدة gastrulation34. وبالمثل، فإن الهدف 20x يسمح لتصوير جنينين داخل طائرة تصوير واحدة. وتوفر الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول منصة دينامية لطرح الأسئلة البيولوجية باستخدام التنمية الجنينية كنظام نموذجي للتحليل الكمي.
هناك 3 خطوات هامة في هذا البروتوكول. بعد dechorionation في 50٪ تبييض من الضروري أن يتم شطف الأجنة وتجفيفها بقوة 5 مرات (2.3.4). هذه الخطوة يزيل أي بقايا قطع صغيرة من chorion. سوف بقايا chorion عرقلة مجال الرؤية عند تصوير الجنين. عند تركيب الأجنة على غطاء الزجاج (3.5)، من المهم الضغط على الأجنة على الغراء مع ضغط موحد. وهذا سوف يضع الأجنة على نفس الطائرة z. عند قطع فتح إبرة الحقن المجهري، من المهم سحب المكبس على الفور لضبط معدل تدفق الإبرة أو سوف تفقد كل ما تبذلونه من الحقن.
كانت دراستنا محدودة بعوامل اثنين. العامل الأول هو عدم وجود عملية تجزئة آلية. قمنا بتصميم سيناريو تجزئة يدوي باستخدام MATLAB ، ومع ذلك ، مع علامة المغزل المشفرة وراثيا يمكن أن تكون هذه العملية الآلي. في المستقبل نود أن تنتج CNN-RFP21،RTLN1-GFP و CNN-RFP؛ خطوط ReepB-GFP المعدلة وراثيا لتمكين تجزئة المغزل الآلي. لمزيد من المعلومات حول خط MATLAB وخط أنابيب التحليل ، راجع المواد التكميلية من Diaz etal. 15. ثانيا، كنا أيضا محدودة من قبل لدينا فترة اقتناء 35 s، والتي سمحت لنا فقط لتصوير 6 أجنة في وقت واحد. فترة حيازة أطول من شأنها أن تسمح لنا لصورة المزيد من الأجنة في وقت واحد. على الرغم من أن إنتاجية تسليم المخدرات يمكن أن تزيد عن طريق استبدال الحقن المجهري مع خطوة تغلغل، وجدنا أن هذا غير ضروري لأن حجم العينة لدينا كان محدودا بالفعل من قبل فترة الاقتناء.
في حين تم استخدام هذا البروتوكول لصورة Drosophila تطوير الجنينية، والنهج الشامل هو قابل للتكيف لدراسة التنمية الجنينية في أنظمة نموذج متعددة الخلايا الأخرى، مثل C. elegans،قنفذ البحر، وXenopus. الأجنة مفيدة للغاية للتحليل الكمي لأنها متزامنة بسهولة عن طريق الجمع أو الإخصاب. بالإضافة إلى ذلك، لا تتحرك الأجنة أو تسبح بعيداً عن مجال الرؤية، مما يتيح استخدام برنامج بسيط للاكتساب متعدد النقاط قادر على إنتاج مقاطع فيديو متعددة للفاصل الزمني للتحليل الكمي. على الرغم من أننا استخدمنا محلل محتوى عالي في دراستنا ، يمكن أن يقترن أي نظام مجهر مقلوب قادر على الاستحواذ متعدد النقاط بالطرق المشار إليها هنا.
ويمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام احتياز متعدد النقاط يمكن أن يُعكس مجهراً مقلوباً؛ ومع ذلك، تظهر مزايا محلل المحتوى العالي كـ أحد يزيد حجم العينة لدراسة الأسئلة التي تتطلب دقة أقل في الوقت. ميزة واضحة لاستخدام محلل المحتوى العالي هو القدرة على صورة 4 شرائح منفصلة في وقت واحد مقارنة مع 1 الشريحة على النظم التقليدية. مع مجموعة كاملة من 4 شرائح و 40 أجنة على كل شريحة، يمكن تصوير 160 جنينا على مدى عدة ساعات، طالما أن فترة الاستحواذ هي 15 دقيقة على الأقل بين الإطارات. ميزة أخرى هامة لاستخدام محلل المحتوى العالي هي أن العينات مغلقة تماما من أي مصادر الضوء الخارجي، وهو أمر ضروري لقياسات كثافة الفلوريسينس القائمة على. وأخيرا، فإن محلل المحتوى العالي المستخدم في دراستنا لديه كاميرا CMOS 5.5 ميجابيكسل التي توفر حقل عرض سخي 221.87 ميكرومتر في التكبير 60x. وقد مكننا هذا المجال الأكبر من الرؤية من تصوير نصف جنين لكل نقطة اقتناء.
The authors have nothing to disclose.
UD، WFM و BR مدعومة من قبل مركز البناء الخلوي، وهو مركز العلوم والتكنولوجيا (NSF) المؤسسة الوطنية، بموجب اتفاقية منحة DBI-1548297. كما يتم دعم BR من خلال جائزة NSF Career، 1553695.
10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
Culture Well Silicone Sheet Material – 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
Silica gel beads, desiccant ~ 2 – 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
EQUIPMENT | |||
Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |