זיהום של עכברים יילודים עם bioluminescent E. coli O1:K1:H7 תוצאות זיהום ספיגה עם דלקת ריאות משמעותית ופתולוגיה ריאות. כאן, אנו מתארים נהלים למודל וחקר נוסף אלח דם יילודים באמצעות הדמיה תוך ויציתית אורך במקביל ללקטואר של נטל חיידקי מערכתי, פרופיל דלקתי, היסטופתולוגיה ריאות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניאונים נמצאים בסיכון מוגבר לאח דם חיידקי בשל הפרופיל החיסוני הייחודי שהם מציגים בחודשים הראשונים לחיים. הקמנו פרוטוקול לחקר הפתוגנזה של E. coli O1:K1:H7, סרוטיפ האחראי לשיעורי תמותה גבוהים בערימות. השיטה שלנו משתמשת בהדמיה תוך-בלתי נמנעת של גורי יילודים בנקודות זמן שונות במהלך התקדמות הזיהום. הדמיה זו, המקבילה למדידת חיידקים בדם, פרופיל דלקתי והיסטופתולוגיה של רקמות, מסמלת גישה קפדנית להבנת דינמיקת הזיהום במהלך אלח דם. בדו"ח הנוכחי, אנו מודל שני inoculums זיהומיות להשוואה של נטל חיידקי וחומרת המחלה. אנו מוצאים כי זיהום תת-שרירי מוביל לזיהום מופץ על ידי 10 שעות לאחר ההדבקה. על ידי 24 שעות, זיהום של זוהר E. coli היה בשפע בדם, ריאות, ורקמות היקפיות אחרות. ביטוי של ציטוקיני דלקתיות בריאות הוא משמעותי ב 24 שעות, וזה ואחריו חדירה תאית וראיות של נזק לרקמות כי עולה עם מינון זיהומיות. להדמיה תוך-ויתית יש כמה מגבלות. זה כולל סף אות זוהר וכמה סיבוכים שיכולים להתעורר עם בירנים במהלך ההרדמה. למרות כמה מגבלות, אנו מוצאים כי מודל הזיהום שלנו מציע תובנה להבנת דינמיקת זיהום אורך במהלך אלח דם מורין יילודים, זה לא נבדק ביסודיות עד כה. אנו מצפים מודל זה יכול להיות מותאם גם ללמוד זיהומים חיידקיים קריטיים אחרים במהלך החיים המוקדמים.
מבוא
אלח דם חיידקי הוא דאגה משמעותית עבור neonates המציגים פרופיל חיסוני ייחודי בימים הראשונים של החיים שאינו מספק הגנה נאותה מפניזיהום 1. אלח דם יילודים ממשיך להיות בעיה משמעותית בארה"ב. בריאות חשבונאות יותר מ 75,000 מקרים בשנה בארה"בלבדה 2. כדי לחקור את זיהומים אלה לעומק, מודלים חדשניים של בעלי חיים כי recapitulate היבטים של מחלות אנושיות נדרשים. הקמנו מודל זיהום עכבר יילודים באמצעות Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli הוא הגורם המוביל השני של אלח דם יילודים בארה"ב, אבל אחראי על רוב התמותה הקשורים אלחדם 4,5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים אושרו על ידי הוועדות לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים במערב וירג'יניה ונערך בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה על ידי המועצה הלאומיתלמחקר 18.
1. הכנת Inoculum בקטריאלי
- פס אגר סויה טריפטי (TSA) צלחת עם לולאה חיסון לבידוד של מושבה אחת ממלאי מקפיא של E. coli O1:K1:H7-lux המבטאת לוציפראז באופן יציב ונושאת עמידות קנאמיצין3. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
- למחרת לאפשר מרק לוריא (LB) לבוא לטמפרטורת החדר (25 °C (60 °F) ב ארון biosafety.
- מתחת למכסה המנוע של ארון biosafety, לזהות מושבה אחת מהצלחת מפוספסת לחסן אותו 3 מ"ל של LB בתוס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה גרם לאח דם חיידקי בעכברים יילודים, והשתמשנו בהדמיה תוך-חוץ-אודינלית, ספירת חיידקים בדם, הערכות היסטולוגיות של פתולוגיה ופרופילי ביטוי ציטוקיני דלקתיים כדי לחקור את מהלך המחלה. סימנים של תחלואה נצפו בגורים יילודים נגועים הן נמוך (~ 2 x 106 CFUs) וגבוה (~ 7 x10 6 CFUs) inoculums של E.coli לאורך זמן. גורים שקיבלו את ההתגלמות הגדולה יותר הראו סימני מצוקה בולטים יותר שכללו ירידה בניידות, חוסר היכולת לתקן את יציבתם ויכולת לקויה לשמור על מצב זקוף ב-24 שעות לאחר ההדבקה (hpi). עם זאת, הי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודל הזיהום התת-שרירי שלנו לחידוש אלח דם חיידקי בעכברים יילודים הוא שיטה חדשנית לחקר התפשטות האורך של פתוגנים חיידקיים בזמן אמת. הדמיה תוך-תתיאטרית מספקת את ההזדמנות לחקור הפצת חיידקים בזמן אמת ביאלונדטים. זה קריטי כדי להבין את הקינטיקה של הפצת חיידקים כדי להמשיך לחקור את התגובה המארחת ואת הנזק בשלב המתאים של המחלה. גורי עכבר מנוהלים תת עורית, הזרקה תת-עורית של אינוקולום חיידקי. טכניקת הזרקה זו פשוטה יותר מאשר חלופות נפוצות אחרות, כגון וריד הזנב וזיהומים תוך-חוץ-חיים, כיוון שהיא דורשת פחות דיוק בתוך אתר הזרקה. זה חשוב בה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מוסדיות .M.R.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 מ"ל מזרק אינסולין | Coviden | 1188128012 | Inoculum או PBS הזרקת |
| 10% ניטרלי חוצץ פורמלין | VWR | 89370-094 | היסטופתולוגיה |
| ACK מאגר ליזה | Gibco | LSA1049201 | בדיקת פינוי חיידקים בעלי |
| חיים קעקוע דיו | הדבק Ketchum | KI1482039 | זיהוי בעלי חיים |
| קעקוע דיו משחה ירוקה | Ketchum | KI1471039 | זיהוי בעלי חיים |
| אנטי-Ly-6B.2 מיקרו-חרוזים | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | בידוד תאים |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (מבטא לוציפראז) | N/A | N/ | A נבנה בתוך הבית ב-WVU |
| E.Z.N.A. HP ערכת RNA מיצוי כוללת | אומגה ביו-טק | R6812 | תוספת RNA |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco טריפטי סויה אגר | בקטון, דיקינסון ושות' | 236950 | גידול חיידקים |
| IL-1 בטא פריימר/בדיקה (MM00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 ביטוי ציטוקינים qPCR | |
| IL-6 פריימר/בדיקה (MM00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | ביטוי ציטוקינים qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | PCR כמותית |
| iScript cDNA | Bio-Rad | 1708891 | סינתזת cDNA |
| מאגר בידוד | Miltenyi Biotec | N/A | בדיקת פינוי חיידקים |
| ספקטרום IVIS CT ותמונה חיה 4.5 תוכנה | Perkin Elmer | N/A | הדמיה תוך-חיונית |
| מרק LB, לנוקס | פישר BioReagents | BP1427-500 | גידול חיידקים |
| EASYstrainer (סל ניילון) | Greiner Bio-one | 542 040 | מסננת תאים |
| SpectraMax iD3 | מכשירים מולקולריים | N/A | קורא צלחות |
| גלולה מנוע | עלי Grainger | 6HAZ6 | הומוגניזציה של רקמות |
| פוליפרופילן גלולה Pestles | Grainger | 6HAY5 | הומוגניזציה של רקמות |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA סינתזה |
| TNF-alpha פריימר/בדיקה (MM00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | ביטוי ציטוקינים qPCR |
| TriReagent (GTCP) | מרכז מחקר מולקולרי | TR 118 | תוספת RNA |
מקורות
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014). <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
