ההפעלה של סר/ת’ר קינאז AURKA רב תכליתית מסומנת על ידי ההתפשטות האוטומטית שלה על Thr288. בדיקות פלואורסצנטיות המסתמכות על FRET יכולות להפלות בין המצבים הלא פעילים והפעילים שלה. כאן, אנו מדגימים כמה אסטרטגיות להנדסת בדיקה, יחד עם פרוטוקול FRET מהיר כדי לעקוב אחר הפעלת קינאז לאורך מיטוזה.
סרטן האפיתל מסומן לעתים קרובות על ידי ביטוי יתר של Ser / Thr קינאז אורורה A / AURKA. AURKA הוא חלבון רב תכליתי המופעל על ההתפשטות האוטומטית שלו על Thr288. שפע AURKA מגיע לשיאו במיטוזה, שם הוא שולט ביציבות ובנאמנות של הציר המיטוטי, וביעילות הכללית של מיטוזה. למרות מאופיין היטב ברמה המבנית, ניטור עקבי של ההפעלה של AURKA לאורך מחזור התא חסר. פתרון אפשרי מורכב משימוש בביו-סנסורים של העברת אנרגיית תהודה (FRET) המקודדים גנטית של Förster כדי לקבל תובנה לגבי החשיפה האוטומטית של AURKA עם רזולוציה מרחבית מספקת. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדס biosensors FRET זיהוי Thr288 autophosphorylation, וכיצד לעקוב אחר שינוי זה במהלך מיטוזה. ראשית, אנו מספקים סקירה כללית של זוגות FRET תורמים/מקבלים אפשריים, ואנו מראים שיטות שיבוט והכנסה אפשריות של ביו-סנסורים של AURKA FRET בתאי יונקים. לאחר מכן, אנו מספקים ניתוח שלב אחר שלב למדידות FRET מהירות על ידי מיקרוסקופיה הדמיה לכל החיים פלואורסצנטיות (FLIM) על התקנה שנבנתה בהתאמה אישית. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על פתרונות מסחריים חלופיים הזמינים. אנו מסכמים על ידי התחשבות בבקרות FRET המתאימות ביותר עבור ביו-סנסור מבוסס AURKA, ועל ידי הדגשת שיפורים עתידיים פוטנציאליים כדי להגביר עוד יותר את הרגישות של כלי זה.
אורורה קינאז A/AURKA הוא סרין רב תכליתי/קינאז תרוניני, פעיל לאורך מחזור התאים ובתאים תת-תאיים שונים1. הבנת ההפעלה המרחבית הרחבה שלה חשובה במיוחד בסרטן, שכן AURKA מתבטאת לעתים קרובות יתר על המידה בממאירות אפיתל והמטולוגית, כאשר חולים מראים היענות לקויה לטיפולים הזמינים כיום2.
מחקרים מבניים גילו כי AURKA עוברת שני שלבים כדי להפוך מ קינאז לא פעיל לקינאז פעיל. ראשית, החשיפה האוטומטית של Thr288 משנה את הקונפורמציה של הכיס הקינטי של הקינאז ומפעילה אותו 3,4,5,6. צעד זה מגביר את הפעילות הקטליטית של AURKA בתאים אנושיים ובקסנופוס לאביס3,6,7, ומכין את הקינאז לפעילות מלאה. לאחר ההפעלה, האינטראקציה של AURKA עם חלבון הפילוח עבור Xklp2 (TPX2) גורמת לשינוי קונפורמציה שני5. שינוי נוסף זה מאפשר לאאורקה להגיע לפעילות אנזימטית מלאה לקראת המצעים שלה בתא 5,8,9,10.
במשך כמעט שני עשורים, תובנות על ההפעלה והפעילות של AURKA התקבלו בעיקר באמצעות שילוב של גישות ביוכימיות. אלה כוללים את הזיהוי של Thr288 זרחן בתאים או ויוו כסימן היכר של הפעלת AURKA, ניתוחים קריסטלוגרפיים, במבחנה או בבדיקות קינאז צלולו כדי לחקור את הפעילות של AURKA1. עם זאת, הרזולוציה המרחבית של גישות אלה היא ירודה או נעדרת, והיה צורך בפתרונות חדשניים כדי להרחיב את הידע על הדינמיקה של שני אירועים אלה.
הפיתוח של בדיקות פלואורסצנטיות בשנים האחרונות הקל על ניטור של AURKA בתאים חיים, ומאפשר את הבא של הפעלתו עם רזולוציה מרחבית גדולה יותר. החיישנים הספציפיים ביותר עבור AURKA שפותחו עד כה מסתמכים על עיקרון FRET (העברת אנרגיית התהודה של Förster)11 כדי להפלות בין AURKA לא פעילה ופעילה. החיישן הראשון שפותח היה ביו-סנסור מבוסס מצע של פעילות AURKA kinase. ביו-סנסורים מבוססי מצע מורכבים על ידי רצף אמינו-סידי קצר המיועד לקינאז נתון לזרחן, ומוכנסים בתוך זוג FRET של תורם/מקבל ותחום מחייב המזהה את שאריות הזרחן, המסייע בקיפול הביו-סנסור לתהליך FRET יעיל12. במקרה של AURKA, שבר 14-aminoacid של KIF2C ממוקד על ידי זרחן הוכנס בין תורם CFP-YFP / מקבל זוג13. עם זאת, לחיישן זה יש כמה חסרונות גדולים. ראשית, רצף KIF2C המשמש בגשוש זה יכול להיות ממוקד הן על ידי AURKA והן על ידי קינאז AURKB הקשורים קשר הדוק, ובכך להקטין את הספציפיות של biosensor זה. שנית, החיישן מסתמך על קינאז אנדוגני עבור זרחן. לכן, יעילות FRET יכולה להיות בלתי ניתנת לגילוי או לא משמעותית אם כמויות הקינאז מגבילות (למשל, בתאים תת-תאיים או בשלבי מחזור תאים). כדי להתגבר על מגבלות אלה, סוג חדש של חיישן AURKA נוצר המכונה “חיישנים קונפורמצונליים”. בבדיקות אלה, הרצף באורך מלא של AURKA הוכנס בתוך פלואורופור תורם ב N-terminus, ופלואורופור מקבל ב C-טרמינוס. AURKA הלא פעילה מציגה קונפורמציה “פתוחה”, המרחיקה את ה- N וה- C-termini של הקינאז זה מזה. עם מרחק כזה בין שני termini (> 10 ננומטר), זוג התורם / מקבל נמצאים בתצורה לא מתירנית עבור FRET. להיפך, AURKA האוטוספורית מאמצת קונפורמציה “סגורה”, כאשר שני טרמיני החלבון ושני הפלורופורים נמצאים בסמיכות. זה הוכח לאפשר FRET בין התורם לבין המקבל, אשר ניתן למדוד באמצעות הווריאציות בחיי התורם14,15. בדיקות כאלה מציגות מספר יתרונות. ראשית, הם מקודדים גנטית, והם יכולים לשמש כדי להחליף את קינאז אנדוגני בתא. שנית, הם מצילים את הפנוטיפים הנגרמים על ידי הנוקאאוט של AURKA, המציין כי הם פונקציונליים בתא. שלישית, הם מאפשרים לעקוב אחר ההפעלה של קינאז בתאים תת-תאיים שונים ולאורך מחזור התא. הבדיקות זיהו את ההפעלה של AURKA במקומות שבהם הקינאז ידוע להיות מופעל (כלומר centrosomes ואת הציר המיטוטי), וגם השתתפו בגילוי ההפעלה של AURKA במיטוכונדריה16. לבסוף, חיישנים אלה אפשרו הקרנות תוכן גבוה המבוססות על FRET / FLIM, שם השינויים הקונפורמציה של AURKA שימשו לזיהוי מעכבים פרמקולוגיים חדשניים17.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים הליך להמחשה של הפעלת AURKA בתאים מתורבתים. ראשית, אנו נעשה תובנה על זוגות פלואורופור פוטנציאליים עבור FRET. הבחירה של זוג התורמים/ מקבל המתאים ביותר תיעשה על פי הגדרת המיקרוסקופ הזמינה, או יישום במורד הזרם מסוים כמו מולטיפלקס FRET18,19. לאחר מכן, אנו מציעים צינור כדי לחקור את ההתנהגות של biosensor(ים) שנבחר בהגדרת מיקרוסקופ FRET / FLIM מהירה. צינור זה יתרחב מתרביות תאים ותהליכי סינכרון לרכישת FLIM וניתוח נתונים. לבסוף, נדון ביתרונות הפוטנציאליים של פרוטוקול זה, שכן אסטרטגיה אנלוגית לעיצוב ביו-סנסור יכולה להיות מיושמת על קינאות אחרות, וניתן להשתמש בה גם עם מערכות הדמיה אחרות המבוססות על FRET.
biosensors FRET מקודדים גנטית הם כלים אמינים למדידת ההפעלה של חלבונים בודדים או של מסלולי איתות שלמים41. במיוחד, הביו-סנסור AURKA FRET מהווה דרך מועדפת לחקור את ההפעלה של הקינאז בזמן ובמרחב. עם זאת, אלמנטים מסוימים ראויים לתשומת לב מיוחדת בעת תכנון או אופטימיזציה של ביו-סנסור FRET, לא רק במונחים כלליים אלא ליתר דיוק עבור AURKA.
ראשית, ניתן להתאים את האופי ואת המיקום היחסי של זוג FRET התורם / מקבל עבור פונקציות ספציפיות של קינאז זה. AURKA מועשרת מאוד בציר המיטוטי במהלך מיטוזה, אך היא קיימת לאורך מחזור התא ובמיקומים תת-תאיים שונים (למשל, צנטרוזומים, הגרעין והמיטוכונדריה)1,2. אם יש להשתמש ב- biosensor בתאים ספציפיים כמו מיטוכונדריה, אשר יכול להגיע pH חומצי, הבחירה של pH-insensitive תורם-מקבל זוג FRET כמו mTurquoise2 / shadowG צריך להיעשות. יתר על כן, הצבת תורם FRET בטרמינל C יכול לאפשר הדמיה טובה יותר של biosensor בתא תת-תאי זה, ואולי אפילו לייעל את זיהוי FRET בהתחשב בכך AURKA N-terminus הוכח לבקע חלקית במיטוכונדריה16,42.
שנית, דרך שטרם נחקרה לייעל את הביו-סנסור של AURKA FRET תדרוש תכנון זהיר יותר של מקשרים בין AURKA באורך מלא לבין זוג התורמים/מקבלי ההחלטות. לא רק המרחק בין הזוג הפלואורסצנטי, אלא גם המאפיינים של המקשר עצמו הוכחו כגורמים מרכזיים לשיפור יעילות FRET43,44,45,45,46. לאור זאת, הגדלת הנוקשות או הגמישות של המקשר עלולה לפגוע ביעילות FRET, או לשפר אותה עוד יותר.
שלישית, ידוע כי ביטוי יתר של AURKA גורם חריגות ציר מיטוטי בחלק משמעותי של תאים2. זה יהיה מעניין להשוות ΔLifetime המתקבל על ידי ביטוי אותו מבנה FRET תחת מקדם חזק כמו cytomegalovirus (CMV) – אחד היזמים הנפוצים ביותר שנמצאו וקטורים ביטוי יונקים – או תחת רצף מקדם מינימלי AURKA (CTTCCGG)14,47. מקדם זה הוכח בעבר כדי להציל מונופולים או צירים רב קוטביים הנובעים לאחר הפלת קינאז, והשימוש בו לא גרם הפרעות מחזור התאים ל se14,47. למרות ש-FLIM אינו רגיש לרמות ביטוי החלבון ולריכוזים היחסיים בתא11, ההנאה מהשוואה יסודית של שני היזמים באותו מערך ביו-סנסור תרחיב את ההבנה של מאגר AURKA המופעל בכל מקום נתון. בנוסף, הוא יספק תובנות חדשניות על האופן שבו הפעלת AURKA עשויה להשתנות עם הבעת יתר, אשר רלוונטית לפרדיגמות סרטן אפיתל והמטולוגיות.
לבסוף, יש לקחת בחשבון גם את יישום FRET במורד הזרם. נקודת מבט עתידית בתחום של AURKA תהיה לצבור את הביו-סנסור הקונפורמי של קינאז עם ביו-סנסור מבוסס מצע. ניתוח התנהגות FRET של שני ביו-סנסורים בו זמנית – תהליך המכונה מולטיפלקס FRET – דורש מקבל כהה על biosensor הראשון כדי למנוע דימום ספקטרלי דרך בערוץ התורם השני. בהקשר של AURKA, זה יפתח את נקודת המבט החדשה והמרגשת של זיהוי ההפעלה של הקינאז עם הביו-סנסור הראשון, והפעילות האנזימטית שלו כלפי מצע נתון עם השני. ההתפתחויות האחרונות במולטיפלקסינג מאפשרות כעת לצבור עד שלושה ביו-סנסורים בכל פעם48. יישום שיטה דומה בהקשר של AURKA יכול לייצג אסטרטגיה מבטיחה מאוד לא רק כדי לבדוק את יחסי הגומלין הפעלה-פעילות של קינאז, אלא גם לחקור מפלי איתות AURKA עם רזולוציה מרחבית חסרת תקדים.
לסיכום, FRET/FLIM היא דרך נוחה להעמיק את הידע על פעילות החלבון. מצד אחד, הוא מאפשר לדמיין את הלוקליזציה של חלבון נתון בתאים חיים, הודות לפחות moiety פלואורסצנטי אחד. מצד שני, זה יכול לפענח שינויים קונפורמציה חלבון, אשר יכול להיות אינפורמטיבי על הפעלת חלבון ו / או פעילות. לכן, FRET / FLIM ו biosensors FRET קונפורמציה יש את הפוטנציאל של הפיכת שיטות נפוצות לעקוב אחר מסלולי איתות בתאים חיים, ועם רזולוציה spatiotemporal מעולה.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למהנדסי המרכז להדמיית מיקרוסקופיה-רן (MRic, BIOSIT, Rennes, צרפת) על הייעוץ והעזרה, ובמיוחד ל- X. Pinson על קריאה ביקורתית של כתב היד. MRic הוא חבר בתשתית הלאומית France-BioImaging הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04). עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי דה לה Recherche Scientifique (CNRS), ליגה Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère, והאגודה pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) to G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |