Aktiveringen av den multifunktionella Ser/Thr kinas AURKA kännetecknas av dess autofosforylering på Thr288. Fluorescerande sonder som förlitar sig på FRET kan diskriminera mellan dess inaktiva och aktiverade tillstånd. Här illustrerar vi några strategier för sondteknik, tillsammans med ett snabbt FRET-protokoll för att följa kinasaktiveringen genom mitos.
Epitelial cancer kännetecknas ofta av överuttryck av Ser/Thr kinas Aurora A/AURKA. AURKA är ett multifunktionellt protein som aktiveras på sin autofosforylering på Thr288. AURKA överflöd toppar i mitos, där det styr stabiliteten och återgivningen av den mitotiska spindeln och den totala effektiviteten av mitos. Även om väl karakteriseras på strukturell nivå, saknas en konsekvent övervakning av aktiveringen av AURKA under hela cellcykeln. En möjlig lösning består i att använda genetiskt kodade Försters fret-biosensorer (Resonance Energy Transfer) för att få insikt i autofosforyrening av AURKA med tillräcklig spatiotemporal upplösning. Här beskriver vi ett protokoll för att konstruera FRET biosensorer upptäcka Thr288 autophosphorylation, och hur man följer denna modifiering under mitos. Först ger vi en översikt över möjliga donator/acceptor FRET par, och vi visar möjliga kloning och insättningsmetoder av AURKA FRET biosensorer i däggdjursceller. Sedan tillhandahåller vi en steg-för-steg-analys för snabba FRET-mätningar genom fluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) på en specialbyggd installation. Detta protokoll är dock också tillämpligt på alternativa kommersiella lösningar som finns tillgängliga. Vi avslutar med att överväga de lämpligaste FRET-kontrollerna för en AURKA-baserad biosensor, och genom att lyfta fram potentiella framtida förbättringar för att ytterligare öka känsligheten hos detta verktyg.
Aurorakinas A/AURKA är en multifunktionell serin/treoninkinas, aktiv under hela cellcykeln och vid olika subcellulära fack1. Förstå dess breda spatiotemporal aktivering är särskilt viktigt i cancer, eftersom AURKA ofta är överuttryckt i epitelial och hematologiska maligniteter, med patienter som visar dålig lyhördhet för de för närvarande tillgängliga terapierna2.
Strukturella studier visade att AURKA genomgår två steg för att konvertera från en inaktiv till en aktiv kinas. För det första ändrar autofosforyeringen av Thr288 konformationen av kinas kinetiska ficka och aktiverar den3,4,5,6. Detta steg ökar den katalytiska aktiviteten hos AURKA i mänskliga celler och i Xenopus laevis3,6,7, vilket priming av kinas för full aktivitet. När AURKA har aktiverats inducerar interaktionen mellan AURKA och målproteinet för Xklp2 (TPX2) en andra konformationsförändring5. Denna ytterligare modifiering gör det möjligt för AURKA att nå full enzymatisk aktivitet mot sina substrat i cellen5,8,9,10.
Under nästan två decennier erhölls insikter om aktivering och aktivitet av AURKA främst genom en kombination av biokemiska metoder. Dessa inkluderar detektion av fosforylerad Thr288 i celler eller in vivo som ett kännetecken för AURKA aktivering, kristallografiska analyser och in vitro eller i cellulo kinas analyser för att undersöka aktiviteten av AURKA1. Den spatiotemporala upplösningen av dessa tillvägagångssätt är dock dålig eller frånvarande, och nya lösningar behövdes för att bredda kunskapen om dynamiken i dessa två händelser.
Utvecklingen av fluorescerande sonder under de senaste åren underlättade övervakningen av AURKA i levande celler, vilket möjliggör följande av dess aktivering med större spatiotemporal upplösning. De mest specifika sensorerna för AURKA som hittills utvecklats förlitar sig på FRET-principen (Försters resonansenergiöverföring)11 för att diskriminera mellan inaktiv och aktiv AURKA. Den första sensorn som utvecklades var en substratbaserad biosensor av AURKA kinasaktivitet. Substratbaserade biosensorer består av en kort aminoacidsekvens som är riktad mot ett givet kinas för fosforylering och sätts in i ett givar/acceptor FRET-par och en bindningsdomän som känner igen fosforylerade rester, vilket hjälper till att vika biosensorn för en effektiv FRET-process12. När det gäller AURKA sattes ett 14-aminoacid fragment av KIF2C som är mål för fosforylering mellan en CFP-YFP givare/acceptor par13. Denna sensor har dock några stora nackdelar. För det första kan KIF2C-sekvensen som används i denna sond riktas både mot AURKA och det närbesläktade kinaset AURKB, vilket minskar specificiteten hos denna biosensor. För det andra förlitar sig sensorn på det endogena kinaset för fosforylering. Därför kan FRET-effektiviteten vara oidentifierbar eller inte signifikant om mängden av kinasen är begränsande (t.ex. i subcellulära fack eller cellcykelfaser). För att övervinna dessa begränsningar skapades en ny klass av AURKA-sensor som kallas “conformational sensorer”. I dessa sonder infogades sekvensen av AURKA i en donator fluorophore vid N-ändstationen och en acceptor fluorofor vid C-ändstationen. Inaktiv AURKA presenterar en “öppen” konformation, som tar N- och C-termini av kinasen bort från varandra. Med ett sådant avstånd mellan de två termini (> 10 nm) är donator-/acceptorparet i en icke-tillåtande konfiguration för FRET. Tvärtom antar autofosforylerad AURKA en “sluten” konformation, med de två proteintermini och de två fluoroforerna i närheten. Detta visade sig möjliggöra FRET mellan givaren och acceptorn, som kan mätas med hjälp av variationerna i donatorns livstid14,15. Sådana sonder ger flera fördelar. För det första är de genetiskt kodade, och de kan användas för att ersätta det endogena kinaset i cellen. För det andra räddar de fenotyper som induceras av knockdown av AURKA, vilket indikerar att de är funktionella i cellen. För det tredje tillåter de att följa aktiveringen av kinasen vid olika subcellulära fack och under hela cellcykeln. Sonderna upptäckte aktiveringen av AURKA på platser där det är känt att kinasen är aktiverad (dvs. centrosomer och den mitotiska spindeln) och deltog också i upptäckten av aktiveringen av AURKA vid mitokondrierna16. Slutligen tillät dessa sensorer screening med högt innehåll baserat på FRET/FLIM, där de konformationella förändringarna av AURKA användes för att identifiera nya farmakologiska hämmare17.
I det nuvarande arbetet beskriver vi ett förfarande för att visualisera AURKA aktivering i odlade celler. Först kommer vi att göra en inblick i potentiella fluorofrepar för FRET. Valet av det lämpligaste donator-/acceptorparet kommer att göras enligt den tillgängliga mikroskopinställningen, eller en viss nedströmsapplikation som multiplex FRET18,19. Sedan föreslår vi en pipeline för att utforska beteendet hos den eller de biosensorer som valts i en snabb FRET / FLIM-mikroskopinställning. Den här pipelinen kommer att sträcka sig från cellkultur- och synkroniseringsprocedurer till FLIM-förvärv och dataanalys. Slutligen kommer vi att diskutera de potentiella fördelarna med detta protokoll, eftersom en analog strategi för biosensordesign kan tillämpas på andra kinaser, och det kan också användas med andra FRET-baserade bildsystem.
Genetiskt kodade FRET-biosensorer är tillförlitliga verktyg för att mäta aktivering av enskilda proteiner eller av hela signalvägar41. Särskilt AURKA FRET-biosensorn utgör ett prioriterat sätt att utforska aktiveringen av kinasen i tid och rum. Vissa element förtjänar dock särskild uppmärksamhet när man utformar eller optimerar en FRET-biosensor, inte bara i allmänna termer utan mer specifikt för AURKA.
För det första kan arten och den relativa positionen för givaren/acceptor FRET-paret anpassas för specifika funktioner i detta kinas. AURKA är kraftigt berikad vid mitotisk spindel under mitos, men det är närvarande under hela cellcykeln och på olika subcellulära platser (t.ex. centrosomer, kärnan och mitokondrier)1,2. Om biosensorn ska användas i specifika fack som mitokondrier, som kan nå surt pH, bör valet av ett pH-okänsligt donator-acceptor FRET-par som mTurquoise2/shadowG göras. Dessutom, placera FRET givaren vid C-terminus kan möjliggöra en bättre visualisering av biosensorn vid detta subcellulära fack, och potentiellt även optimera FRET upptäckt med tanke på att AURKA N-terminus visade sig delvis klyva av vid mitokondrier16,42.
För det andra skulle ett ännu outforskat sätt att optimera biosensorn AURKA FRET kräva en noggrannare utformning av länkar mellan AURKA i full längd och givar-/acceptorparet. Inte bara avståndet mellan det fluorescerande paret, utan också egenskaperna hos själva länkaren visade sig vara nyckelfaktorer för att förbättra FRET-effektiviteten43,44,45,46. Mot denna bakgrund kan en ökning av länkarens styvhet eller flexibilitet antingen vara skadlig för FRET:s effektivitet eller ytterligare förbättra den.
För det tredje är det känt att överuttryck av AURKA inducerar mitotiska spindelavvikelser i en betydande andel av cellerna2. Det skulle vara intressant att jämföra ΔLifetime som erhållits genom att uttrycka samma FRET-konstruktion under en stark promotor som cytomegalovirus (CMV) – en av de vanligaste promotorerna som finns i däggdjursuttryck vektorer – eller under AURKA minimal promotor sekvens (CTTCCGG)14,47. Denna promotor visade sig tidigare rädda monopolära eller multipolära spindlar som uppstod efter nedslagningen av kinasen, och dess användning inducerade inte cellcykelperturationer i sig14,47. Även om FLIM är okänsligt för proteinuttrycksnivåer och relativa koncentrationer i cellen11, skulle dra nytta av en grundlig jämförelse av de två promotorerna på samma biosensorinställning bredda förståelsen av poolen av aktiverad AURKA på en viss plats. Dessutom skulle det ge nya insikter om hur AURKA aktivering kan förändras vid överuttryck, vilket är relevant för epitelial och hematologic cancer paradigm.
Slutligen bör även fret-ansökan i efterföljande led beaktas. Ett framtidsperspektiv inom AURKA skulle vara att kumulera kinaskonformationella biosensor med en substratbaserad biosensor. Att analysera FRET-beteendet hos två biosensorer samtidigt – en process som kallas multiplex FRET – kräver en mörk acceptor på den första biosensorn för att undvika spektralblödning i den andra givarkanalen. I samband med AURKA skulle detta öppna upp det spännande nya perspektivet att upptäcka aktiveringen av kinasen med den första biosensorn och dess enzymatiska aktivitet mot ett givet substrat med det andra. Den senaste utvecklingen inom multiplexering gör det nu möjligt att kumulera upp till tre biosensorer åt gången48. Att tillämpa en liknande metod i samband med AURKA kan representera en mycket lovande strategi inte bara för att testa aktiveringsaktivitetsinterplay av kinasen, men också för att utforska AURKA-signalkaskader med oöverträffad spatiotemporal upplösning.
Sammanfattningsvis är FRET/FLIM ett bekvämt sätt att fördjupa kunskapen om proteinaktivitet. Å ena sidan gör det möjligt att visualisera lokaliseringen av ett givet protein i levande celler, tack vare minst en fluorescerande munterhet. Å andra sidan kan det riva upp proteinkonformationella förändringar, vilket kan vara informativt om proteinaktivering och / eller aktivitet. Därför har FRET/FLIM och conformational FRET biosensorer potential att bli utbredda metoder för att följa signalering vägar i levande celler, och med utsökt spatiotemporal upplösning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar ingenjörerna vid Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Frankrike) för råd och hjälp, och särskilt X. Pinson för kritisk läsning av manuskriptet. MRic är medlem i den nationella infrastrukturen France-BioImaging med stöd av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-10-INBS-04). Detta arbete stöddes av Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère och Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) till G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |