Aktiveringen af den multifunktionelle Ser /Thr kinase AURKA er hallmærket af sin autophosphorylation på Thr288. Fluorescerende sonder, der er afhængige af FRET, kan skelne mellem dets inaktive og aktiverede tilstande. Her illustrerer vi nogle strategier for sondeteknik sammen med en hurtig FRET-protokol til at følge kinaseaktivering gennem hele mitose.
Epitelkræft er ofte hallmærket af overekspression af Ser / Thr kinase Aurora A / AURKA. AURKA er et multifunktionelt protein, der aktiveres ved sin autophosphorylation på Thr288. AURKA overflod toppe i mitose, hvor det styrer stabiliteten og troskaben af mitotisk spindel, og den samlede effektivitet af mitose. Selvom godt karakteriseret på det strukturelle niveau, mangler en konsekvent overvågning af aktiveringen af AURKA gennem hele cellecyklussen. En mulig løsning består i at bruge genetisk kodede Försters FRET-biosensorer (Resonance Energy Transfer) til at få indsigt i autophosphorylation af AURKA med tilstrækkelig spatiotemporal opløsning. Her beskriver vi en protokol til ingeniør FRET biosensorer, der registrerer Thr288 autophosphorylation, og hvordan man følger denne ændring under mitose. For det første giver vi et overblik over mulige donor/acceptor FRET-par, og vi viser mulige klonings- og indsættelsesmetoder af AURKA FRET biosensorer i pattedyrsceller. Derefter leverer vi en trinvis analyse til hurtige FRET-målinger ved fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) på en specialbygget opsætning. Denne protokol gælder dog også for alternative kommercielle løsninger, der er tilgængelige. Vi slutter med at overveje de mest hensigtsmæssige FRET-kontroller for en AURKA-baseret biosensor og ved at fremhæve potentielle fremtidige forbedringer for yderligere at øge følsomheden af dette værktøj.
Aurora kinase A/AURKA er en multifunktionel serin/threonine kinase, aktiv i hele cellecyklussen og i forskellige subcellulære rum1. Forståelse af dens brede spatiotemporal aktivering er særlig vigtig i kræft, da AURKA ofte er overekspresseret i epitel og hæmatologiske maligniteter, hvor patienterne udviser dårlig lydhørhed over for de aktuelt tilgængelige behandlinger2.
Strukturelle undersøgelser viste, at AURKA gennemgår to trin for at konvertere fra en inaktiv til en aktiv kinase. For det første ændrer autophosphorylation af Thr288 kropsbygning af kinasens kinetiske lomme og aktiverer den3,4,5,6. Dette trin øger AURKA’s katalytiske aktivitet i menneskelige celler og i Xenopus laevis3,6,7, priming kinase for fuld aktivitet. Når den er aktiveret, fremkalder AURKA’s interaktion med målproteinet til Xklp2 (TPX2) en anden kropsbygningsændring5. Denne yderligere ændring gør det muligt for AURKA at nå fuld enzymatisk aktivitet mod sine substrater i cellen5,8,9,10.
I næsten to årtier blev indsigt i aktivering og aktivitet af AURKA opnået hovedsageligt gennem en kombination af biokemiske tilgange. Disse omfatter påvisning af fosforyleret Thr288 i celler eller in vivo som et kendetegn for AURKA aktivering, krystallografiske analyser, og in vitro eller i cellulo kinase assays at sonde aktiviteten af AURKA1. Imidlertid er den spatiotemporale løsning af disse tilgange dårlig eller fraværende, og der var behov for nye løsninger for at udvide kendskabet til dynamikken i disse to begivenheder.
Udviklingen af fluorescerende sonder i de sidste par år lettet overvågningen af AURKA i levende celler, så følgende af dens aktivering med større spatiotemporal opløsning. De mest specifikke sensorer til AURKA, der er udviklet indtil videre, er afhængige af FRET-princippet (Försters Resonans Energy Transfer)11 for at skelne mellem inaktive og aktive AURKA. Den første udviklede sensor var en substratbaseret biosensor af AURKA kinase aktivitet. Substratbaserede biosensorer udgøres af en kort aminoacidisk sekvens, der er målrettet af en given kinase til fosforylering, og indsættes i et donor/acceptor FRET-par og et bindende domæne, der genkender den fosforylerede rest, som hjælper foldningen af biosensoren til en effektiv FRET-proces12. For AURKA’s vedkommende blev der indsat et 14-aminosyre fragment af KIF2C, der var mål for fosforylering, mellem en CFP-YFP-donor/acceptorpar13. Denne sensor har dog nogle store ulemper. For det første kan den KIF2C-sekvens, der anvendes i denne sonde, målrettes både af AURKA og den nært beslægtede kinase AURKB, hvorved specificiteten af denne biosensor reduceres. For det andet er sensoren afhængig af den endogene kinase til fosforylering. Fret-effektiviteten kan derfor være målbart eller ikke signifikant, hvis mængden af kinase er begrænsende (f.eks. i subcellulære rum eller cellecyklusfaser). For at overvinde disse begrænsninger blev der oprettet en ny klasse af AURKA-sensor kendt som “kropsbygningssensorer”. I disse sonder blev AURKA’s sekvens i fuld længde indsat i en donorfluoriort ved N-endestationen og en acceptorfluoriphe ved C-endestationen. Inaktive AURKA præsenterer en “åben” kropsbygning, som bringer N- og C-termini af kinase væk fra hinanden. Med en sådan afstand mellem de to termini (> 10 nm) er donor/acceptorparret i en ikke-eftergivende konfiguration for FRET. Tværtimod vedtager autophosphoryleret AURKA en “lukket” kropsbygning, med de to protein termini og de to fluorophorer i nærheden. Dette viste sig at gøre det muligt for FRET mellem donoren og acceptoren, som kan måles ved hjælp af variationerne i donorlevetiden14,15. Sådanne sonder giver flere fordele. For det første er de genetisk kodede, og de kan bruges til at erstatte den endogene kinase i cellen. For det andet redder de fænotyper forårsaget af knockdown af AURKA, hvilket indikerer, at de er funktionelle i cellen. For det tredje gør de det muligt at følge aktiveringen af kinasen på forskellige subcellulære rum og i hele cellecyklussen. Sonderne opdagede aktiveringen af AURKA på steder, hvor kinase er kendt for at være aktiveret (dvs. centrosomes og mitotisk spindel), og deltog også i at opdage aktiveringen af AURKA på mitokondrier16. Endelig tillod disse sensorer screeninger med højt indhold baseret på FRET/FLIM, hvor de kropslige ændringer af AURKA blev brugt til at identificere nye farmakologiske hæmmere17.
I dette arbejde beskriver vi en procedure til at visualisere AURKA aktivering i dyrkede celler. For det første vil vi få et indblik i potentielle fluorophorepar til FRET. Valget af den mest egnede donor / acceptor par vil blive foretaget i henhold til den tilgængelige mikroskop setup, eller en bestemt downstream ansøgning som multiplex FRET18,19. Derefter foreslår vi en rørledning til at udforske adfærden af biosensor (r) valgt i en hurtig FRET / FLIM mikroskop setup. Denne pipeline strækker sig fra cellekultur- og synkroniseringsprocedurer til FLIM-anskaffelse og dataanalyse. Endelig vil vi diskutere de potentielle fordele ved denne protokol, da en analog strategi for biosensordesign kan anvendes på andre kinaser, og det kan også bruges sammen med andre FRET-baserede billedsystemer.
Genetisk kodede FRET biosensorer er pålidelige værktøjer til at måle aktiveringen af enkelte proteiner eller af hele signalveje41. Især AURKA FRET biosensor udgør en præference måde at udforske aktiveringen af kinase i tid og rum. Nogle elementer fortjener dog særlig opmærksomhed, når de designer eller optimerer en FRET biosensor, ikke kun generelt, men mere specifikt til AURKA.
For det første kan arten og den relative position af donor / acceptor FRET par tilpasses til specifikke funktioner i denne kinase. AURKA er stærkt beriget på mitotisk spindel under mitose, men det er til stede i hele cellecyklussen og på forskellige subcellulære steder (f.eks centrosomes, kernen og mitokondrier)1,2. Hvis biosensoren skal anvendes i bestemte rum som mitokondrier, som kan nå sur pH, skal valget af et pH-ufølsomt donor-acceptor FRET-par som mTurquoise2/shadowG foretages. Desuden kunne placere FRET donor på C-endestationen tillade en bedre visualisering af biosensor på denne subcellulære rum, og potentielt endda optimere FRET detektion givet, at AURKA N-endestation viste sig at delvist kløve ud på mitokondrier16,42.
For det andet ville en endnu uudforsket måde at optimere AURKA FRET biosensoren kræve et mere omhyggeligt design af linkere mellem AURKA i fuld længde og donor/acceptorparret. Ikke kun afstanden mellem det fluorescerende par, men også egenskaberne af linkeren selv viste sig at være nøglefaktorer for at forbedre FRET-effektiviteten43,44,45,46. I dette lys kan en forøgelse af linkerens stivhed eller fleksibilitet enten være til skade for FRET’s effektivitet eller yderligere forbedre den.
For det tredje er det kendt, at overekspression af AURKA inducerer mitotisk spindel abnormiteter i en betydelig del af cellerne2. Det ville være interessant at sammenligne ΔLifetime opnået ved at udtrykke den samme FRET konstruktion under en stærk promotor som cytomegalovirus (CMV) – en af de mest almindelige initiativtagere findes i pattedyr udtryk vektorer – eller under AURKA minimal promotor sekvens (CTTCCGG)14,47. Denne promotor blev tidligere vist at redde monopolar eller multipolar spindler opstår efter knock-down af kinase, og dens anvendelse ikke fremkalde celle cyklus forstyrrelser per se14,47. Selv om FLIM er ufølsom over for proteinudtryksniveauer og relative koncentrationer i cellen11, vil en grundig sammenligning af de to initiativtagere på samme biosensoropsætning udvide forståelsen af puljen af aktiveret AURKA på et givet sted. Derudover vil det give ny indsigt i, hvordan AURKA-aktivering kan ændre sig ved overekspression, hvilket er relevant for epitel- og hæmatologiske kræftparadigmer.
Endelig bør der også tages hensyn til FRET-ansøgningen i det efterfølgende omsætningsled. Et fremtidigt perspektiv inden for AURKA ville være at cumulate kinase conformational biosensor med en substratbaseret biosensor. Analyse af FRET adfærd af to biosensorer samtidigt – en proces kendt som multiplex FRET – kræver en mørk acceptor på den første biosensor for at undgå spektral blødning igennem i den anden donorkanal. I forbindelse med AURKA ville dette åbne op for det spændende nye perspektiv at opdage aktiveringen af kinase med den første biosensor og dens enzymatiske aktivitet mod et givet substrat med det andet. Den seneste udvikling inden for multiplexing gør det nu muligt at kumulere op til tre biosensorer ad gangen48. Anvendelse af en lignende metode i forbindelse med AURKA kunne repræsentere en meget lovende strategi ikke kun for at teste aktiveringsaktivitetsinterplayet af kinase, men også for at udforske AURKA-signalering kaskader med hidtil uset spatiotemporal opløsning.
Afslutningsvis er FRET/FLIM en bekvem måde at uddybe viden om proteinaktivitet på. På den ene side gør det muligt at visualisere lokaliseringen af et givet protein i levende celler takket være mindst en fluorescerende moiety. På den anden side kan det optrævle proteinkonformationelle ændringer, som kunne være informative om proteinaktivering og / eller aktivitet. Derfor har FRET/FLIM og kropsbygning FRET biosensorer potentiale til at blive udbredte metoder til at følge signalveje i levende celler og med udsøgt spatiotemporal opløsning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker ingeniørerne i Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Frankrig) for rådgivning og hjælp, og især X. Pinson for kritisk læsning af manuskriptet. MRic er medlem af den nationale infrastruktur France-BioImaging støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-10-INBS-04). Dette arbejde blev støttet af Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère og Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) til G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |