आरएनए-एसईक्यू का उपयोग करके आणविक विकास और जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए एक बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएनए अनुक्रमण डेटा का उपयोग करके उम्मीदवार जीन के विकास और अभिव्यक्ति की जांच करना है।
Abstract
पूरे जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम डेटा जैसे बड़े डेटासेट को डिस्टिल करना और रिपोर्ट करना अक्सर एक चुनौतीपूर्ण काम होता है। परिणामों को तोड़ने का एक तरीका यह है कि एक या एक से अधिक जीन परिवारों पर ध्यान केंद्रित किया जाए जो जीव और अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एक फिलोजेनी उत्पन्न करने और ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए जैव सूचनात्मक कदमों की रूपरेखा तैयार करते हैं। फिलोजेनेटिक पेड़ इस बारे में जानकारी दे सकते हैं कि जीन प्रजातियों के भीतर और बीच कैसे विकसित हो रहे हैं और साथ ही ऑर्थोलॉजी का पता चलता है। इन परिणामों को विभिन्न व्यक्तियों या ऊतकों में इन जीनों की अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए आरएनए-एसईक्यू डेटा का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है। आणविक विकास और अभिव्यक्ति के अध्ययन प्रजातियों के बीच विकास और जीन समारोह के संरक्षण के तरीकों को प्रकट कर सकते हैं। एक जीन परिवार के लक्षण वर्णन भविष्य के अध्ययन के लिए एक स्प्रिंगबोर्ड के रूप में सेवा कर सकते है और एक नए जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम कागज में एक महत्वपूर्ण जीन परिवार को उजागर कर सकते हैं ।
Introduction
अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने जीनोम और गैर-मॉडल जीवों के ट्रांसक्रिप्टोम के अनुक्रमण को सुगम बनाया है । कई जीवों से अनुक्रमण डीएनए और आरएनए की बढ़ी हुई व्यवहार्यता के अलावा, ब्याज के जीन का अध्ययन करने के लिए डेटा की बहुतायत सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आणविक विकास और जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए जैव सूचनाबद्ध कदम प्रदान करना है जो ब्याज के जीव में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
एक जीन या जीन परिवार के विकास की जांच जैविक प्रणालियों के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । एक जीन परिवार के सदस्यों को आम तौर पर संरक्षित रूपांकनों या अनुरूप जीन दृश्यों की पहचान करके निर्धारित कर रहे हैं । जीन परिवार विकास पहले दूर से संबंधित मॉडल जीवों से जीनोम का उपयोग कर जांच की थी1। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे इन जीन परिवारों को बारीकी से संबंधित प्रजातियों में विकसित और विभिंन पर्यावरण चयनात्मक दबावों की भूमिका । इस प्रोटोकॉल में, हम बारीकी से संबंधित प्रजातियों में समरूपता के लिए एक खोज शामिल हैं। एक फिलम स्तर पर एक फिलोजेनी पैदा करके, हम जीन परिवार के विकास में प्रवृत्तियों जैसे संरक्षित जीन या वंश-विशिष्ट दोहराव के रूप में नोट कर सकते हैं । इस स्तर पर हम यह भी जांच कर सकते हैं कि जीन ऑर्थोलोग हैं या पैरालॉग। जबकि कई समरूपता की संभावना एक दूसरे के समान कार्य करते हैं, यह जरूरी नहीं कि मामला2है । इन अध्ययनों में फिलोजेनेटिक पेड़ों को शामिल करना यह हल करना महत्वपूर्ण है कि ये समरूप जीन ऑर्थोलोग हैं या नहीं । यूकेरियोट्स में, कई ऑर्थोलोग कोशिका के भीतर समान कार्यों को बनाए रखते हैं जैसा कि स्तनधारी प्रोटीन की क्षमता से खमीर ऑर्थोलॉग3के कार्य को बहाल करने के लिए है। हालांकि, ऐसे उदाहरण हैं जहां एक गैर-ऑर्थोलोलॉगस जीन एक विशेषता कार्य4को अंजाम देता है।
फिलोजेनेटिक पेड़ जीन और प्रजातियों के बीच संबंधों को चित्रित करना शुरू करते हैं, फिर भी कार्य को पूरी तरह से आनुवंशिक संबंधों के आधार पर नहीं सौंपा जा सकता है। कार्यात्मक एनोटेशन और संवर्धन विश्लेषण के साथ संयुक्त जीन अभिव्यक्ति अध्ययन जीन समारोह के लिए मजबूत समर्थन प्रदान करते हैं। ऐसे मामले जहां जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की जा सकती है और व्यक्तियों या ऊतक प्रकारों की तुलना में संभावित कार्य के बारे में अधिक बता सकते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल हाइड्रा वल्गैरिस7में ऑप्सिन जीन की जांच में उपयोग किए जाने वाले तरीकों का पालन करता है, लेकिन उन्हें किसी भी प्रजाति और किसी भी जीन परिवार पर लागू किया जा सकता है। इस तरह के अध्ययनों के परिणाम गैर-मॉडल जीवों में जीन समारोह और जीन नेटवर्क की आगे की जांच के लिए एक आधार प्रदान करते हैं । एक उदाहरण के रूप में, ऑप्सिन के फिलोजेनी की जांच, जो प्रोटीन हैं जो फोटोट्रांसडक्शन झरना शुरू करते हैं, आंखों के विकास और प्रकाश का पता लगाने8,9,10, 11के संदर्भ देता है। इस मामले में, गैर-मॉडल जीव विशेष रूप से बेसल पशु प्रजातियां जैसे कि सिनेडियन या सीटीनोफोरस12, 13,14में संरक्षण या फोटोट्रांसडक्शन झरना और दृष्टि में परिवर्तन को स्पष्ट करसकतेहैं। इसी तरह, अन्य जीन परिवारों के फिलोजेनी, अभिव्यक्ति और नेटवर्क का निर्धारण हमें आणविक तंत्र अंतर्निहित रूपांतरों के बारे में सूचित करेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएनए-एसईक्यू डेटा का उपयोग करके जीन परिवार की विशेषता के लिए चरणों की रूपरेखा प्रदान करना है। ये विधियां विभिन्न प्रजातियों और डेटासेट 4 ,34,35के लिए क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एड्रियाना ब्रिस्को, गिल स्मिथ, रबी मुराद और एलिन जी रंगेल को हमारे कार्यप्रवाह में इनमें से कुछ चरणों को शामिल करने में सलाह और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए कैथरीन विलियम्स, एलिसाबेथ रिब्बोह और नताशा पिक्सियानी के भी आभारी हैं । इस काम को ए.M.M के लिए मेडिकल रिसर्च फेलोशिप के लिए जॉर्ज ई. हेविट फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।
Materials
| Bioanalyzer-DNA kit | Agilent | 5067-4626 | wet lab materials |
| Bioanalyzer-RNA kit | Agilent | 5067-1513 | wet lab materials |
| BLAST+ v. 2.8.1 | On computer cluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
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| Blast2GO (on your PC) | On local computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic |
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| boost v. 1.57.0 | On computer cluster | ||
| Bowtie v. 1.0.0 | On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ |
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| Computing cluster (highly recommended) | NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large. | ||
| Cufflinks v. 2.2.1 | On computer cluster | ||
| edgeR v. 3.26.8 (in R) | In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html |
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| gcc v. 6.4.0 | On computer cluster | ||
| Java v. 11.0.2 | On computer cluster | ||
| MEGA7 (on your PC) | On local computer https://www.megasoftware.net |
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| MEGAX v. 0.1 | On local computer https://www.megasoftware.net |
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| NucleoSpin RNA II kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | wet lab materials |
| perl 5.30.3 | On computer cluster | ||
| python | On computer cluster | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | wet lab materials |
| R v.4.0.0 | On computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/ |
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| RNAlater | ThermoFisher | AM7021 | wet lab materials |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | wet lab materials |
| RSEM v. 1.3.0 | Computer software https://deweylab.github.io/RSEM/ |
||
| RStudio v. 1.2.1335 | On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download |
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| Samtools v. 1.3 | Computer software | ||
| SRA Toolkit v. 2.8.1 | On computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit |
||
| STAR v. 2.6.0c | On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR |
||
| StringTie v. 1.3.4d | On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ |
||
| Transdecoder v. 5.5.0 | On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases |
||
| Trimmomatic v. 0.35 | On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic |
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| Trinity v.2.8.5 | On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases |
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| TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | wet lab materials |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | wet lab materials |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | wet lab materials |
| *Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator. |
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