एक अंग पर एक चिप 3 डी मॉडल, मशीन लर्निंग, और Confocal टोमोग्राफी का उपयोग कर मस्तिष्क मेटास्टेटिक ट्यूमर माइक्रो पर्यावरण की मात्रा
Summary
यहां, हम एक रक्त मस्तिष्क बाधा मेटास्टेटिक ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण को तैयार करने और उसे बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और फिर कॉन्फोकल इमेजिंग और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (मशीन लर्निंग) का उपयोग करके अपने राज्य की मात्रा निर्धारित करते हैं।
Abstract
मस्तिष्क मेटास्टेस सबसे घातक कैंसर घाव हैं; कैंसर के प्रकार के आधार पर, केवल ~ 5-20 महीनों के औसत अस्तित्व के साथ, सभी कैंसर का 10-30% मस्तिष्क में मेटास्टेसाइज करता है। मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ को कम करने के लिए, बुनियादी और अनुवाद ज्ञान में अंतराल को दूर करने की जरूरत है । प्रमुख चुनौतियों में प्रजनन योग्य प्रीक्लीनिकल मॉडल और संबद्ध उपकरणों की कमी शामिल है। मस्तिष्क मेटास्टेसिस के त्रि-आयामी मॉडल समर्पित विश्लेषण उपकरणों के साथ संयुक्त होने पर इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक आणविक और फेनोटाइपिक डेटा प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, मुरीन मॉडल की तुलना में, रोगी ट्यूमर कोशिकाओं के अंग-ऑन-ए-चिप मॉडल मस्तिष्क माइक्रोएनवायरमेंट में रक्त मस्तिष्क बाधा को पार करते हैं, तेजी से परिणाम उत्पन्न करते हैं और मात्रात्मक तरीकों के साथ अधिक व्याख्या योग्य होते हैं, इस प्रकार उच्च थ्रूपुट परीक्षण के लिए उत्तरदायी होते हैं। यहां हम एक उपन्यास 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक रक्त मस्तिष्क आला (μmBBN) मंच के उपयोग का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं जहां आला के कई तत्वों को एक विस्तारित अवधि (कई दिनों) के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट रूप से इमेज्ड, और एक अभिनव कॉन्फोकल टोमोग्राफी तकनीक का उपयोग करके पुनर्निर्मित छवियों; सभी का उद्देश्य माइक्रो-मेटास्टेसिस के विकास और ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण (टीएमई) में एक दोहराने योग्य और मात्रात्मक तरीके से परिवर्तन को समझना है। हम इस मंच का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं और टीएमई सेलुलर और ह्यूमरल घटकों का निर्माण, बीज, छवि और विश्लेषण कैसे करते हैं, इसका प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि कैसे आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (एआई) का उपयोग कैंसर कोशिकाओं के आंतरिक फेनोटाइपिक मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जाता है जो एक मॉडल μmBBN के माध्यम से पारगमन करने में सक्षम हैं और उन्हें मस्तिष्क मेटास्टैटिक क्षमता का एक उद्देश्य सूचकांक प्रदान करते हैं। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा सेट का उपयोग मेटास्टेसिस के बारे में बुनियादी और अनुवादात्मक प्रश्नों, चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता और दोनों में टीएमई की भूमिका के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
मस्तिष्क मेटास्टेस सबसे घातक कैंसर घाव हैं; सभी कैंसर का 10-30% मस्तिष्क के लिए मेटास्टेसाइज, केवल ~ 5-20 महीने के औसत अस्तित्व के साथ, कैंसर प्रकार1,,2पर निर्भर करता है । कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करते समय एक प्रमुख प्रश्न यह उठता है कि उप क्लोन रक्तधारा के विनोदी वातावरण से मस्तिष्क3,4जैसे अंग में कैसे प्रवास करते हैं । इस सवाल के कारण पलायन, आक्रमण और अपर्णा में कई भिन्नताएं हैं। ये सभी विधियां कोशिकाओं के गुणों को गिनने या मापने के महत्वपूर्ण कदम को साझा करती हैं जो उत्तेजना के जवाब में एक स्थान से दूसरे स्थान पर जाती हैं। अधिकांश माइग्रेशन परख आसानी से उपलब्ध है कैंसर कोशिकाओं के दो आयामी (2 डी) प्रवास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। इनसे ज्ञान का खजाना स्पष्ट हो गया है; हालांकि, वे वीवो सिस्टम में तीन आयामी प्रकृति का पुनर्पूंजीकरण नहीं करते हैं कि अन्य तरीके5प्रदान कर सकते हैं । इसलिए, त्रि-आयामी (3 डी) प्रणालियों में ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण (टीएमई) का अध्ययन करना आवश्यक है, लेकिन 3 डी संरचनाओं के लिए उपलब्ध विश्लेषण दृष्टिकोण सीमित हैं और अक्सर असंगत होते हैं।
सबसे लोकप्रिय 3 डी उपकरणों में से एक बॉयडन चैंबर है जिसमें एक कुएं के तल पर निलंबित झिल्ली होती है, जो दो अलग-अलग क्षेत्रों को अलग करती है। बॉयडन ने ल्यूकोसाइट केमोटैक्सिस4का अध्ययन करने के लिए परख की शुरुआत की । निचले क्षेत्रों को निचले क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए ऊपरी क्षेत्र में कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए रसायन विज्ञान या अन्य साधनों6,,7 द्वारा भिन्न किया जा सकता है। माइग्रेट की गई कोशिकाओं की संख्या को निर्धारित करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण यह है कि एक बफर समाधान का उपयोग करके झिल्ली के नीचे से कोशिकाओं को जारी किया जाए, उन्हें lyse किया जाए, और फिर समाधान7में डीएनए सामग्री की मात्रा के आधार पर उन्हें गिनें। यह अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण तकनीक परिवर्तनशीलता के कारण ऑपरेटर त्रुटि से ग्रस्त है और प्रक्रिया कैंसर फेनोटाइप और सूक्ष्म पर्यावरण के बारे में जानकारी को नष्ट कर देती है। बॉयडन चैम्बर परख की विविधताओं में झिल्ली पर रहने वाली प्रवासी कोशिकाओं का निर्धारण शामिल है, लेकिन केवल उन कोशिकाओं की गिनती प्रदान करता है जो,अब निरंतर अध्ययन6,,8,9के लिए व्यवहार्य नहीं हैं।
बॉयडन चैंबर की सीमाओं और माइक्रोफ्लुइडिक समुदाय में नवाचारों के विकास के कारण, माइग्रेशन परख चिप्स विकसित किए गए हैं जो तीन 10 ,11, 12,11,12के बजाय एक दिशा में उत्तेजना के जवाब में कोशिकाओं की गति का पालन करते हैं। ये माइग्रेशन परख प्रवाह या एकल कोशिका पृथक्करण13, 14,14 जैसे कारकों पर नियंत्रण की सुविधा प्रदान करते हैं जो परिणामों की बेहतर व्याख्या को सक्षम करते हैं; हालांकि, उनका 2D प्रारूप अनिवार्य रूप से कुछ गतिशील जानकारी खो देता है। हाल के अध्ययनों में 3 डी वातावरण14, 15,15में एक ऊतक में परिसंचरण से कोशिकाओं की आवाजाही (यानी, रक्त मस्तिष्क बाधा) पर ध्यान केंद्रित किया है। सेलुलर बैरियर/झिल्ली पर होने वाले ऊतक और जांच व्यवहार में अपूथ दूरी बॉयडन चैंबर या 2डी माइक्रोफ्लुइडिक माइग्रेशन डिवाइस16का उपयोग करके प्राप्त मापों की तुलना में अधिक परिष्कृत होती है । इस प्रकार, उपकरणों है कि उचित इमेजिंग और 3 डी एक्स्ट्राावेशन के विश्लेषण सक्षम इन परिष्कृत माप पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन साहित्य में कमी कर रहे हैं ।
माइग्रेशन परख से स्वतंत्र, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और टोमोग्राफी के लिए मजबूत इमेजिंग तकनीक विकसित की गई है जो 3 डी स्पेस17,,18में ऊतकों की पहचान और सटीक पुनर्निर्माण करने में सक्षम हैं। ये तकनीकें ऊतक के गुणों के आधार पर जेड-स्टैक और छवि के खंड भागों में छवियां प्राप्त करती हैं और फिर खंडित छवियों को त्रि-आयामी meshes19,20,,21में परिवर्तित करती हैं।, यह चिकित्सकों को 3 डी व्यक्तिगत अंगों, हड्डियों और जहाजों में कल्पना करने की अनुमति देता है ताकि कैंसर या हृदय रोगके,निदान में शल्य चिकित्सा योजना या सहायता में सहायता की जासके। यहां, हम बताएंगे कि इन दृष्टिकोणों को सूक्ष्म नमूनों और 3 डी अपूश उपकरणों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस उद्देश्य के लिए, हमने अभिनव कॉन्फोकल टोमोग्राफी तकनीक विकसित की, जो यहां प्रस्तुत की गई है, जो मौजूदा टोमोग्राफी उपकरणों को अनुकूलित करके एक झिल्ली में ट्यूमर कोशिकाओं के अपव्यय का अध्ययन करने के लिए लचीलापन प्रदान करती है। यह दृष्टिकोण कैंसर सेल व्यवहार के पूर्ण सरगम के अध्ययन को सक्षम बनाता है क्योंकि वे एक सेलुलर बाधा के साथ बातचीत करते हैं, जैसे कि एंडोथेलियल सेल परत। कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार की जांच प्रदर्शन; कुछ आक्रमण कर सकते हैं, लेकिन झिल्ली के करीब रहते हैं, जबकि अन्य बाधा को आसानी से पार करते हैं। यह तकनीक सभी आयामों24में कोशिका के फेनोटाइप के बारे में जानकारी देने में सक्षम है । टीएमई का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करना अपेक्षाकृत सस्ती, व्याख्या करने में आसान और प्रजनन योग्य दोनों है, जब वीवो मुरीन मॉडल में अधिक जटिल की तुलना में। प्रस्तुत पद्धति स्ट्रोमल क्षेत्र को अनुकूल बनाकर कई प्रकार के ट्यूमर और सूक्ष्म वातावरण के अध्ययन के लिए एक मजबूत आधार प्रदान करना चाहिए।
हम 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक रक्त मस्तिष्क आला (μmBBN) मंच(चित्रा 1)के उपयोग का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं जहां बाधा और आला (मस्तिष्क सूक्ष्मकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स) के महत्वपूर्ण तत्वों को एक विस्तारित अवधि (लगभग 9 दिनों तक) के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, फ्लोरोसेंटली रूप से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज डे, और हमारे कॉन्फोसल टॉमोग्राफी का उपयोग करके पुनर्निर्माण की गई छवियां(चित्रा 2) सभी के उद्देश्य से माइक्रो मेटास्टेसिस के विकास को समझने और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण में परिवर्तन एक दोहराने योग्य और मात्रात्मक तरीके से । मस्तिष्क आला के साथ रक्त मस्तिष्क बाधा इंटरफेस मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं से बना है जो बेसमेंट झिल्ली, एस्ट्रोसाइट पैर, और पेरिसाइट्स25द्वारा मजबूत होते हैं। हमने रक्त मस्तिष्क बाधा के गठन और विनियमन में उनके महत्व को देखते हुए एस्ट्रोसाइट और एंडोथेलियल घटकों पर चुनिंदा रूप से ध्यान केंद्रित किया। हम इस मंच का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण सेलुलर और विनोदी घटकों का निर्माण, बीज, छवि और विश्लेषण कैसे करते हैं, इसका प्रदर्शन करते हैं। अंत में, हम दिखाते हैं कि कैसे मशीन लर्निंग का उपयोग कैंसर कोशिकाओं के आंतरिक फेनोटाइपिक मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एक मॉडल μmBBN के माध्यम से पारगमन करने में सक्षम हैं और उन्हें मस्तिष्क मेटास्टेटिक क्षमता24का एक उद्देश्य सूचकांक प्रदान करने के लिए। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा सेट का उपयोग मेटास्टेसिस, चिकित्सीय रणनीतियों और दोनों में टीएमई की भूमिका के बारे में बुनियादी और अनुवादात्मक सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने एक नई विधि विकसित की है और प्रस्तुत की है जो मस्तिष्क के ऊतकों में एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं के अपव्यय और प्रवास के मापन के लिए अक्सर नैदानिक इमेजिंग विश्लेषणों में उपयोग किए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट में एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी कोशिकाओं के उदार दान के लिए स्टीग लैब को धन्यवाद देते हैं । यूनिवर्सिटी ऑफ मिशिगन बायोइंटरफेस इंस्टीट्यूट (बीआई) में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया । फ्लो साइटोमेट्री यूनिवर्सिटी ऑफ मिशिगन फ्लो साइटोमेट्री कोर में किया गया था। वायरल वैक्टर मिशिगन विश्वविद्यालय वेक्टर कोर द्वारा बनाए गए थे । हम इन आंकड़ों के सांख्यिकीय विश्लेषण में मार्गदर्शन के लिए केले किडवेल को भी धन्यवाद देते हैं।
धन:
C.R.O. आंशिक रूप से एक NIH टी-३२ प्रशिक्षण फैलोशिप (T32CA009676) और 1R21CA245597-01 द्वारा समर्थित किया गया था । टी.M डब्ल्यू आंशिक रूप से 1R21CA245597-01 और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के अनुवाद विज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए केंद्र द्वारा पुरस्कार संख्या UL1TR0022240 द्वारा समर्थित किया गया था । पुरस्कार संख्या 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor फाउंडेशन, और स्तन कैंसर अनुसंधान फाउंडेशन के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा सामग्री और लक्षण वर्णन के लिए धन प्रदान किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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