Kvantifiera hjärnan metastaserande tumör mikromiljö med hjälp av en organ-on-A Chip 3D-modell, machine learning, och confocal tomografi
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda och culturing en blod hjärnbarriären ögonbevarande tumör mikro-miljö och sedan kvantifiera sitt tillstånd med hjälp av konfokal avbildning och artificiell intelligens (maskininlärning).
Abstract
Hjärnmetastaser är de mest dödliga cancerlesionerna; 10-30% av alla cancerformer metastasera till hjärnan, med en median överlevnad på endast ~ 5-20 månader, beroende på cancer typ. För att minska hjärnan metastaserande tumör börda, luckor i grundläggande och translationella kunskaper måste åtgärdas. Stora utmaningar är bland annat en brist på reproducerbara prekliniska modeller och tillhörande verktyg. Tredimensionella modeller av hjärnmetastas kan ge de relevanta molekylära och fenotypiska data som används för att hantera dessa behov när de kombineras med dedikerade analysverktyg. Dessutom, jämfört med murine modeller, organ-on-a-chip modeller av patientens tumörceller korsar blod-hjärnbarriären i hjärnan mikromiljö generera resultat snabbt och är mer tolkningsbara med kvantitativa metoder, alltså mottagliga för hög genomströmning testning. Här beskriver vi och demonstrerar användningen av en ny 3D mikrofluidic blod hjärnan nisch (μmBBN) plattform där flera delar av nischen kan odlas under en längre period (flera dagar), fluorescerande avbildas av confocal mikroskopi, och bilderna rekonstrueras med hjälp av en innovativ konfokal tomografi teknik; alla syftar till att förstå utvecklingen av mikro-metastasering och förändringar av tumören mikro-miljö (TME) i en repeterbar och kvantitativt sätt. Vi visar hur man fabricerar, frö, bild, och analysera cancerceller och TME cellulära och humorala komponenter, med hjälp av denna plattform. Dessutom visar vi hur artificiell intelligens (AI) används för att identifiera de inneboende fenotypiska skillnader cancerceller som kan passera genom en modell μmBBN och att tilldela dem ett objektivt index för hjärnans metastaserande potential. De datamängder som genereras av denna metod kan användas för att svara på grundläggande och translationella frågor om metastasering, effekten av terapeutiska strategier, och den roll som TME i båda.
Introduction
Hjärnmetastaser är de mest dödliga cancerlesionerna; 10-30% av alla cancerformer metastasera till hjärnan, med en median överlevnad på endast ~ 5-20 månader, beroende på cancer typ1,2. En huvudfråga som uppstår vid studier av cancermetastas är hur subkloner migrerar från blodomloppets humorala miljö till ett organ som hjärnan3,4. Denna fråga har lett till många varianter av migration, invasion, och extravasation assays. Alla dessa metoder delar det kritiska steget att räkna eller mäta egenskaper hos celler som rör sig från en plats till en annan som svar på en stimulans. De flesta migrationsanalyser lätt tillgängliga används för att studera tvådimensionell (2D) migration av cancerceller. Dessa har klarlagt en rikedom av kunskap; de rekapitulerar dock inte den tredimensionella karaktär av in vivo-systemet som andra metoder kan ge5. Därför är det nödvändigt att studera tumör mikro-miljö (TME) i tredimensionella (3D) system, men analysen metoder som finns för 3D-strukturer är begränsade och ofta inkonsekvent.
En av de mest populära 3D-verktyg är en Boyden kammare som består av ett membran upphängd längst ner i en brunn, som skiljer två olika regioner. Boyden introducerade analysen för att studera leukocyte chemotaxis4. De nedre regionerna kan varieras med hjälp av kemieller andra medel 6,7 för att förmå celler i den övre regionen att migrera till den nedre regionen. Den vanligaste metoden för att kvantifiera antalet celler som har migrerat är att frigöra cellerna från botten av membranet med hjälp av en buffertlösning, lysa dem, och sedan räkna dem baserat på mängden DNA-innehåll i lösningen7. Denna indirekta metod är benägen att operatör fel på grund av tekniken variabilitet och förfarandet förstör information om cancer fenotyp och mikro-miljö. Variationer av Boyden kammaren assay innebära fixering av flyttande celler som finns kvar på membranet, men bara ger en räkning av celler som inte längre är livskraftiga för fortsatt studie6,8,9.
På grund av begränsningar i Boyden kammaren och tillväxten av innovationer i mikrofluidic gemenskapen, migration assay chips har utvecklats som observerar rörelse av celler som svar på en stimulans i en riktning snarare äntre 10,11,12. Dessa migreringsanalyser underlättar kontroll över faktorer som flöde eller encellsseparering13,14 som möjliggör bättre tolkning av resultaten; dock förlorar deras 2D-format oundvikligen en del dynamisk information. Nyligen genomförda studier har fokuserat på extravasation (dvs. förflyttning av celler från cirkulationen till en vävnad, såsom blod-hjärnbarriären) i en 3D-miljö14,15. Den extravasering avstånd till vävnad och sondering beteende som uppstår vid cellulära barriär / membran är mer raffinerad än mätningar som samlats in med antingen Boyden kammaren eller en 2D mikrofluidic migrationenhet 16. Enheter som möjliggör lämplig bildbehandling och analys av 3D-extravasering är således avgörande för att fånga dessa sofistikerade mätningar men saknas i litteraturen.
Oberoende av migreringsanalyser har robusta avbildningstekniker utvecklats för magnetresonanstomografi (MRT) och tomografi som kan identifiera och exakt rekonstruera vävnad i 3D-rymden17,18. Dessa tekniker förvärva bilder i z-stackar och segment delar av bilden baserat på egenskaperna hos vävnaden och sedan omvandla de segmenterade bilderna i tredimensionella maskor19,20,21. Detta gör det möjligt för läkare att visualisera i 3D enskilda organ, ben, och fartyg till stöd i kirurgisk planering eller stöd vid diagnos av cancer eller hjärtsjukdom22,23. Här kommer vi att visa att dessa tillvägagångssätt kan anpassas för användning på mikroskopiska exemplar och 3D extravasering enheter.
För detta ändamål utvecklade vi den innovativa confocal tomografi teknik, som presenteras häri, som ger flexibilitet att studera extravasation av tumörceller över ett membran genom att anpassa befintliga tomografi verktyg. Detta tillvägagångssätt möjliggör studier av hela spektrat av cancercell beteenden som de interagerar med en cellulär barriär, såsom en endotel cellskikt. Cancerceller uppvisar sonderingsbeteenden; vissa kan invadera men förblir nära membranet, medan andra korsar barriären lätt. Denna teknik är kapabel att ge information om fenotyp av cellen i alla dimensioner24. Att använda detta tillvägagångssätt för att studera TME är både relativt billigt, lättolkande och reproducerbart, jämfört med mer komplexa in vivo murine-modeller. Den presenterade metodiken bör ge en stark grund för studier av många typer av tumörer och mikromiljöer genom att anpassa regionen stromal.
Vi beskriver och demonstrerar användningen av en 3D-mikrofluidisk blodhjärnenisch (μmBBN) plattform (Figur 1) där kritiska element i barriären och nischen (hjärnans mikrovaskulära endotelceller och astrocyter) kan odlas under en längre period (ungefär upp till 9 dagar), fluorescerande avbildad av konfokalmikroskopi, och bilderna rekonstruerade med hjälp av vår confo tomografiteknik (Figur 2); alla syftar till att förstå utvecklingen av mikro-metastasering och förändringar i tumören mikro-miljö i en upprepningsbar och kvantitativt sätt. Blod-hjärnbarriären gränssnitt med hjärnan nisch är sammansatt av hjärnans mikrovaskulära endotelceller som stärks av källaren membran, astrocyte fot, och pericyter25. Vi fokuserade selektivt på astrocyten och endotelkomponenterna med tanke på deras betydelse i bildandet och regleringen av blod-hjärnbarriären. Vi visar hur man fabricerar, frö, bild, och analysera cancerceller och tumör mikro-miljö cellulära och humorala komponenter, med hjälp av denna plattform. Slutligen visar vi hur maskininlärning kan användas för att identifiera de inneboende fenotypiska skillnader av cancerceller som är kapabla att transitera genom en modell μmBBN och att tilldela dem ett objektivt index för hjärnans metastaserande potential24. De datamängder som genereras av denna metod kan användas för att svara på grundläggande och translationella frågor om metastasering, terapeutiska strategier och TME:s roll i båda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utvecklat och presenterat en ny metod som anpassar verktyg som ofta utnyttjas i kliniska bildframställningsanalyser för mätning av extravasation och migration av cancerceller genom en endotelbarriär till hjärnvävnad. Vi utgör detta tillvägagångssätt kan vara användbart för både in vivo och in vitro-mätningar; vi har visat dess användning på en 3D microfluidic system recapitulating hjärnan vasculature. Cancer cell mätningar inklusive avstånd extravasated, procent extravasated by volym, sfäricite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Steeg Lab, vid National Cancer Institute för generös donation av MDA-MB-231-BR-GFP celler. Confocal mikroskopi utfördes vid University of Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flödescytometri utfördes vid University of Michigan Flow Cytometry Core. Viral vektorer skapades av University of Michigan Vector Core. Vi tackar också Kelley Kidwell för vägledning i statistisk analys av dessa data.
Finansiering:
C.R.O. stöddes delvis av ett NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) och 1R21CA245597-01. T.M.W. stöddes delvis av 1R21CA245597-01 och National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health under Award Number UL1TR002240. Finansiering för material och karakterisering tillhandahölls av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tilldelning nummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation och Breast Cancer Research Foundation. Innehållet är ensamt författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
