एक दो कदम की रणनीति है कि Epigenetic संशोधन और Biomechanical Cues को जोड़ती है स्तनधारी Pluripotent कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए
Summary
हम यहां एक ऐसी विधि प्रस्तुत करते हैं जो जीन अभिकर्मक या रेट्रोवायरल वैक्टर की आवश्यकता के बिना स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए मेचानोसेंसिंग-संबंधित संकेतों के साथ रासायनिक एपिजेनेटिक मिटाने के उपयोग को जोड़ती है। इसलिए, यह रणनीति ट्रांसलेशनल दवा के लिए आशाजनक है और स्टेम सेल ऑर्गेनोइड तकनीक में एक उल्लेखनीय प्रगति का प्रतिनिधित्व करती है।
Abstract
सेल फेनोटाइप को विभिन्न तरीकों से उलटा या संशोधित किया जा सकता है, जिसमें लाभ और सीमाएं हैं जो प्रत्येक तकनीक के लिए विशिष्ट हैं। यहां हम एक नई रणनीति का वर्णन करते हैं जो स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए मेकेनोसेंसिंग से संबंधित संकेतों के साथ रासायनिक एपिजेनेटिक मिटाने के उपयोग को जोड़ती है। दो मुख्य चरणों की आवश्यकता होती है। पहले चरण में, वयस्क परिपक्व (टर्मिनल रूप से विभेदित) कोशिकाओं को एपिजेनेटिक इरेज़र 5-अजा-साइटिडीन के संपर्क में लाया जाता है ताकि उन्हें प्लुरिपोटेंट राज्य में चलाया जा सके। प्रोटोकॉल का यह हिस्सा विकसित किया गया था, जो सेल भाग्य और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले एपिजेनेटिक तंत्र की बढ़ती समझ के आधार पर विकसित किया गया था, और इसमें सेल विभेदित राज्य को मिटाने के लिए एपिजेनेटिक संशोधक का उपयोग शामिल है और फिर एक क्षणिक उच्च प्लास्टिसिटी विंडो में ड्राइव करना शामिल है।
दूसरे चरण में, मिटाए गए कोशिकाओं को पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) माइक्रो-बायोरिएक्टर में समझाया जाता है, जिसे लिक्विड मार्बल्स के रूप में भी जाना जाता है, ताकि अधिग्रहित उच्च प्लास्टिसिटी को विस्तारित करने और स्थिर रूप से बनाए रखने के लिए 3 डी सेल पुनर्व्यवस्था को बढ़ावा दिया जा सके। पीटीएफई एक गैर-प्रतिक्रियाशील हाइड्रोफोबिक सिंथेटिक यौगिक है और इसका उपयोग सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के निर्माण की अनुमति देता है, जिसे पारंपरिक 2 डी संस्कृति प्रणालियों में प्राप्त नहीं किया जा सकता है। यह प्रणाली प्रोत्साहित करती है और जैव-mechanosensing से संबंधित संकेतों के बावजूद pluripotency के रखरखाव को बढ़ावा देती है।
यहां वर्णित तकनीकी प्रक्रियाएं वयस्क दैहिक कोशिकाओं में एक उच्च प्लास्टिसिटी राज्य के प्रेरण और रखरखाव के लिए अनुमति देने के लिए सरल रणनीतियां हैं। प्रोटोकॉल ने परीक्षण किए गए सभी स्तनधारी प्रजातियों में उच्च प्लास्टिसिटी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति की अनुमति दी। चूंकि इसमें जीन अभिकर्मक का उपयोग शामिल नहीं है और वायरल वैक्टर से मुक्त है, इसलिए यह ट्रांसलेशनल दवा अनुप्रयोगों के लिए एक उल्लेखनीय तकनीकी प्रगति का प्रतिनिधित्व कर सकता है। इसके अलावा, माइक्रो-बायोरिएक्टर सिस्टम इन विट्रो द्वारा स्टेम सेल ऑर्गेनोइड तकनीक में एक उल्लेखनीय प्रगति प्रदान करता है जो एक विशिष्ट सूक्ष्म-पर्यावरण को फिर से बनाता है जो उच्च प्लास्टिसिटी कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति देता है, अर्थात् ईएससी, आईपीएससी, एपिजेनेटिक रूप से मिटाए गए कोशिकाओं और एमएससी के रूप में।
Introduction
पिछले दशकों के दौरान, सेल प्रतिबद्धता और भेदभाव की ओर यूनिडायरेक्शनल प्रगति की व्यापक रूप से स्वीकृत अवधारणा को पूरी तरह से संशोधित किया गया था। यह प्रदर्शित किया गया है कि सेल विनिर्देश को उलटा किया जा सकता है, और एक टर्मिनल रूप से विभेदित सेल को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके कम प्रतिबद्ध और उच्च अनुमेय स्थिति की ओर धकेला जा सकता है।
प्रस्तावित कई तरीकों में से, सबसे आशाजनक विधि में से एक में कोशिकाओं को तथाकथित रासायनिक रूप से प्रेरित प्लूरिफिकेशन में प्रेरित करने के लिए रासायनिक यौगिकों का उपयोग शामिल है। इस दृष्टिकोण में उपयोग किए जाने वाले छोटे अणु एक वयस्क परिपक्व कोशिका के एपिजेनेटिक हस्ताक्षर को बातचीत करने और संशोधित करने में सक्षम हैं, किसी भी ट्रांसजेनिक और / या वायरल वेक्टर 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 की आवश्यकता से बचते हैं। . कई अध्ययनों से हाल ही में पता चला है कि विशिष्ट जैव रासायनिक और जैविक उत्तेजनाओं को प्रदान करके कोशिकाओं को एक फेनोटाइप से दूसरे में स्विच करना संभव है जो हाइपरमेथिलेटेड जीन11,12,13,14,15 के पुनर्सक्रियन को प्रेरित करते हैं। ये demethylating घटनाएं एक आदिम पूर्वज, एक multipotent या एक उच्च plasticity / pluripotent सेल 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 में टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं के रूपांतरण के लिए अनुमति देते हैं।
समानांतर में, कई अध्ययन हाल ही में मेकानोसेंसिंग से संबंधित संकेतों की समझ पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं और, अधिक विशेष रूप से, सेल प्लास्टिसिटी और / या भेदभाव को सीधे प्रभावित करने के लिए यांत्रिक बलों का उपयोग करने की संभावना पर 16,17,18,19। दरअसल, यह स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया है कि बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) सेल भाग्य के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। विशेष रूप से, ईसीएम द्वारा उत्पादित बायोमैकेनिकल और बायोफिजिकल सिग्नल सीधे आणविक तंत्र और सिग्नलिंग मार्गों को विनियमित करते हैं, जो सेल व्यवहार और कार्योंको प्रभावित करते हैं 20,21। इन हालिया आंकड़ों ने उपन्यास 3 डी संस्कृति प्रणालियों के विकास का मार्ग प्रशस्त किया है जो विवो सेल माइक्रोएन्वायरमेंट में अधिक बारीकी से नकल करते हैं, यांत्रिक और शारीरिक उत्तेजनाओं को सेल व्यवहार को चलाने की नकल करते हैं।
हम यहां एक दो-चरणीय प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए मेकानोसेंसिंग से संबंधित संकेतों के साथ रासायनिक एपिजेनेटिक मिटाने के उपयोग को जोड़ता है। पहले चरण में, कोशिकाओं को डिमेथिलेटिंग अणु 5-aza-cytidine (5-aza-CR) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। यह एजेंट प्रत्यक्ष दस-ग्यारह ट्रांसलोकेशन 2 (TET2) के संयुक्त प्रभाव के माध्यम से एक महत्वपूर्ण वैश्विक डीएनए डिमिथाइलेशन को प्रेरित करने में सक्षम है- मध्यस्थता कार्रवाई 8,10 और डीएनए मिथाइलट्रांसफरेज़ (DNMT) 22,23 के अप्रत्यक्ष निषेध। यह कदम एपिजेनेटिक ब्लॉकों को हटाने के लिए प्रेरित करता है, जिसमें बाद में पुन: सक्रियण के साथ प्लूरिबिलिटी से संबंधित जीन अभिव्यक्ति और इसलिए, उच्च प्लास्टिसिटी कोशिकाओं की पीढ़ी 1,2,3,8,10, इसके बाद “एपिजेनेटिक रूप से मिटाई गई कोशिकाओं” के रूप में संदर्भित किया जाता है। दूसरे चरण में, कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति प्रणाली में समझाया जाता है। इस अंत तक, गैर-प्रतिक्रियाशील हाइड्रोफोबिक सिंथेटिक यौगिक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई; 1 μm के कण आकार के साथ) का उपयोग माइक्रो-बायोरिएक्टर के रूप में किया जाता है, जो पारंपरिक 2 डीसंस्कृति प्रणालियों के उपयोग के माध्यम से अप्राप्य सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के निर्माण की अनुमति देता है। पीटीएफई पाउडर कण तरल बूंद की सतह का पालन करते हैं जिसमें कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया जाता है और सहायक सतह से तरल कोर को अलग किया जाता है, जबकि आंतरिक तरल और आसपास के वातावरण के बीच गैस विनिमय की अनुमति देताहै। इस प्रकार प्राप्त “PTFE माइक्रो-बायोरिएक्टर” जिसे “लिक्विड मार्बल” के रूप में भी जाना जाता है, कोशिकाओं को एक-दूसरे के साथ स्वतंत्र रूप से बातचीत करने के लिए प्रोत्साहित करता है, 3 डी सेल पुनर्व्यवस्था को बढ़ावा देता है 25,26,27, और अधिग्रहित उच्च प्लास्टिसिटी राज्य को बढ़ाता है और स्थिर रूप से बनाए रखता है, हालांकि जैव-मेचानोसेंसिंग-संबंधित संकेत10।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले दशकों के दौरान, कई अध्ययनों ने कम प्रतिबद्ध और उच्च अनुमेय राज्य की ओर एक टर्मिनल रूप से विभेदित सेल को वापस करने के लिए रणनीतियों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क पर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को Carraresi Foundation और MiND FoodS Hub ID: 1176436 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। सभी लेखक लागत कार्रवाई CA16119 इन विट्रो 3-डी कुल सेल मार्गदर्शन और फिटनेस (CellFit) के सदस्य हैं।
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
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