Ultra-High-Speed Western Blot ved hjelp av immunoreaction styrke teknologi
Summary
En ultra-høyhastighets vestlig blotting teknikk er utviklet ved å forbedre kinetikk av antigen-antistoff binding gjennom syklisk drenering og etterfylling (CDR) teknologi i forbindelse med en immunoreaction styrkemiddel.
Abstract
En vestlig flekk (også kjent som en immunoblot) er en kanonisk metode for biomedisinsk forskning. Det er ofte brukt til å bestemme den relative størrelsen og overflod av spesifikke proteiner samt post-translasjonelle protein modifikasjoner. Denne teknikken har en rik historie og forblir i utbredt bruk på grunn av sin enkelhet. Imidlertid tar den vestlige blotting prosedyren berømt timer, selv dager, å fullføre, med en kritisk flaskehals er de lange inkubasjonstidene som begrenser gjennomstrømningen. Disse inkubasjonstrinnene er nødvendige på grunn av langsom diffusjon av antistoffer fra bulkløsningen til immobiliserte antigener på membranen: antistoffkonsentrasjonen nær membranen er mye lavere enn bulkkonsentrasjonen. Her presenterer vi en innovasjon som dramatisk reduserer disse inkubasjonsintervallene ved å forbedre antigenbindingen via syklisk drenering og etterfylling (CDR) av antistoffløsningen. Vi benyttet også en immunoreaction styrke teknologi for å bevare følsomheten av analysen. En kombinasjon av CDR-metoden med et kommersielt immunoreaksjonsfremmende middel økte utgangssignalet og reduserte antistoffinkubasjonstiden betydelig. Den resulterende ultra-høyhastighets vestlige blot kan oppnås i 20 minutter uten tap i følsomhet. Denne metoden kan brukes på vestlige flekker ved hjelp av både chemiluminescent og fluorescerende deteksjon. Denne enkle protokollen gjør det mulig for forskere å bedre utforske analysen av proteinuttrykk i mange prøver.
Introduction
En vestlig flekk (også kjent som en immunoblot) er en kraftig og grunnleggende teknikk på tvers av et bredt spekter av vitenskapelige og kliniske disipliner. Denne teknikken brukes til å undersøke tilstedeværelsen, relativ overflod, relativ molekylær masse og post-translasjonelle modifikasjoner av proteiner1. Kombinert med digital bildeanalyse kan denne metoden pålitelig analysere overflod av proteiner og proteinmodifikasjoner2. Selv om vestlig flekk utføres rutinemessig, er det en tidkrevende og arbeidsintensiv metode. Lange inkubasjoner av antistoffet med membraner er nødvendig. Her beskriver vi en endring av inkubasjonsmetoden som overvinner denne begrensningen uten å ofre følsomhet.
Under inkubasjon av membranen flyter antistoffer i oppløsning mens antigener immobiliseres på membranen. På grunn av deres høye affinitet er frekvensen av antistoffbinding til antigenet raskere enn diffusjonen av antistoffer fra bulkløsningen til membranen. Dette skaper et lavt konsentrasjons “uttømmingslag” (figur 1). Det kan ta timer for fjernere antistoffer å nå membranen via passiv diffusjon, som er den viktigste faktoren som er ansvarlig for lange inkubasjonstider i denne teknikken. Denne effekten kalles massetransportbegrensningen (MTL)3. Det har blitt foreslått at repeterende drenering og etterfylling av antistoffholdig løsning kan forstyrre uttømmingslaget og overvinne MTL4. Her har vi utviklet en unik teknikk som implementerer dette sykliske drenerings- og etterfyllingskonseptet (CDR) for å redusere effekten av MTL i en tradisjonell vestlig blottingprotokoll og forkortes bemerket å forkorte den nødvendige inkubasjonsperioden.
For å opprettholde deteksjonsfølsomheten med kort inkubasjonstid, benyttet vi oss av en immunoreaksjonsfremmende teknologi som akselererer antigen-antistoffreaksjonen, og dermed forbedrer signal-til-støy-forholdet5. Mange kommersielt tilgjengelige immunoreaction forsterkende midler (IRE) består av 2 komponenter (løsning 1 og 2, se materialtabell). Den proprietære sammensetningen eller virkningsmekanismen til IRE har ikke blitt avslørt, men vi har tidligere funnet ut at IRE reduserte dissosiasjonskonstanten mellom antigenet og antistoffet i solide fasebindende analyser, noe som indikerer økt affinitet er, i hvert fall delvis, ansvarlig for den forsterkende effekten av IRE6. Kombinasjonen av CDR med IRE gir en ultra-høyhastighets vestlig blottingprotokoll som reduserer hele prosedyretiden uten å ofre følsomhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Western blot er en mye brukt analytisk teknikk for å oppdage spesifikke proteiner som ble utviklet ~ 40 år siden7,8. Siden da har teknikken fortsatt å utvikle seg, med påfølgende innovasjoner som forbedrer følsomheten, hastigheten og kvantitetenav teknikken 2,9,10,11,12,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Division of Intramural Research, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. ble støttet av Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, og H.N. og K.Y. var av Valor og V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
