Dette papiret beskriver fabrikasjonsprotokollen for mikrofluidiske chips utviklet for on-chip proteinkrystallisering med dialysemetoden og in situ X-ray diffraction eksperimenter. Mikrofabrikasjonsprosessen gjør det mulig å integrere en halvgjennomtrengelig regenerert cellulosedialysemembran med en molekylær vekt cut-off, mellom to lag av brikken.
Denne protokollen beskriver produksjon av reproduserbare og rimelige mikrofluidiske enheter som dekker hele rørledningen for krystallisering av proteiner på chip med dialysemetoden og tillater in situ enkeltkrystall- eller seriekrystallografieksperimenter ved romtemperatur. Protokollen beskriver fabrikasjonsprosessen av mikrobrikkene, manipuleringen av krystalliseringseksperimentene på brikken og behandlingen av in situ-innsamlede røntgendiffraksjonsdata for den strukturelle belysningen av proteinprøven. Hovedtrekket i denne mikrofabrikasjonsprosedyren ligger på integreringen av en kommersielt tilgjengelig, halvpermetabel regenerert cellulosedialysemembran mellom to lag av brikken. Den molekylære vektutskjæringen av den innebygde membranen varierer avhengig av makromolekylets molekylvekt og utfellingsstoffene. Enheten utnytter fordelene med mikrofluidisk teknologi, for eksempel bruk av minuttvolumer av prøver (< 1 μL) og finjustering over transportfenomener. Brikken sammenlignet dem med dialysemetoden, noe som gir presis og reversibel kontroll over krystalliseringsprosessen og kan brukes til å undersøke fasediagrammer av proteiner i mikroliterskalaen. Enheten er mønstret ved hjelp av en foto uhelbredelig tiolenbasert harpiks med myk avtrykk litografi på et optisk gjennomsiktig polymer substrat. Videre ble bakgrunnsspødingen av materialene som komponerer mikrobrikkene og genererer bakgrunnsstøy evaluert, noe som gjorde brikken kompatibel for in situ X-ray diffraction eksperimenter. Når proteinkrystaller dyrkes på chip opp til en tilstrekkelig størrelse og befolkningsens ensartethet, kan mikrobrikkene monteres direkte foran røntgenstrålen ved hjelp av en 3D-trykt holder. Denne tilnærmingen tar for seg utfordringene som stiger fra bruk av kryobeskyttende midler og manuell høsting i konvensjonelle proteinkrystallografieksperimenter på en enkel og rimelig måte. Komplette røntgendiffraksjonsdatasett fra flere isomorfe lysozymkrystaller dyrket på chip ble samlet inn ved romtemperatur for strukturbestemmelse.
Belyse den tredimensjonale (3D) strukturen av biologiske makromolekyler er en uopphørlig jakt på strukturell biologi der røntgenkrystallografi forblir den viktigste undersøkelsesteknikken. Anvendt for å løse de strukturelle detaljene i komplekse makromolekyler, som proteiner, tar den sikte på å legge til rette for forståelsen av deres virkningsmekanismer og deres engasjement i ulike biologiske funksjoner. Kraftige røntgenkilder ved synchrotrons og røntgenfrie elektronlasere (XFELs) gir alle verktøyene som kreves for et dypere innblikk i proteinenes struktur ved nær atomoppløsning. Til tross for fordelene som kommer sammen med bruk av røntgenstråler for strukturelle studier, er det iboende begrensninger for røntgenstråling og selve krystalliseringsprosessen. Strålingsskader provosert av høy røntgenfluks og lange eksponeringstider av proteinkrystallen foran røntgenstrålen er restriktive parametere som krystallografer må overgå ved hjelp av kryogenkjøling 1. Det kan imidlertid være å finne de optimale kryooolingsforholdene, siden konformasjonsendringer fra den innfødte proteinstrukturen eller artefaktene kan skjules2,3. Videre indikerer nyere studier at å utføre diffraksjonseksperimenter ved romtemperatur fører til lavere spesifikk strålingsskade4. En annen flaskehals i strukturell biologi er oppkjøpet av velfnærte krystaller med tilstrekkelig størrelse5. Små krystaller er lettere å produsere, spesielt når det gjelder membranproteiner, men er mer utsatt for strålingsskader selv under kryooolingsforhold fordi en høy strålingsdose må rettes i et mindre volum sammenlignet med tilfelle av større proteinkrystaller6. Den nye tilnærmingen til seriekrystallografi7,8 ved synchrotrons og XFELs kan omgå begrensningene av strålingsskader og samtidig utnytte mindre krystaller (200 nm til 2 μm)7 ved å slå sammen datasett fra flere, isomorfe og tilfeldig orienterte proteinkrystaller og profitterer på de tilknyttede teknologiske fremskrittene som femtosecond pulser, kortere eksponeringstider og mikrofokuserterøntgenstråler 5,7,9,10.
Mikrofluidisk teknologi er verdifull for røntgenkrystallografi, og viser mangfoldige fordeler for krystallisering av biologiske makromolekyler og deres strukturelle undersøkelse. Gjennomføring av krystalliseringseksperimenter i mikrofluidiske enheter krever små mengder proteinprøve, og begrenser derfor produksjonskostnadene for disse høyt verdsatte biomakromolekylene og tilrettelegger for screening og optimalisering av mange krystalliseringsforhold. Videre gir det iboende store overflateareal-til-volum-forholdet i mikrofluidisk skala og diffusjonsbegrensede transportfenomener fin kontroll over strømmer og temperatur- eller konsentrasjonsgradienter11,12,13,14,gjengivelse av mikrofluidiske enheter egnet for dyrking av krystaller i ensartet størrelse og utforsking av fasediagrammer15,16,17,18,19. Videre viser mikrofluidiske verktøy et særegent potensial for å løse et annet hinder i proteinkrystallografi, som er prøveleveringen, og nødvendigheten av å håndtere og høste proteinkrystaller før de bruker røntgendiffraksjonseksperimenter. Metoden for on-chip og in situ X-ray krystallografi eliminerer krystall manipulasjon og potensiell forverring av krystallkvalitet før datainnsamling. Et bredt spekter av mikrofluidiske chips som er kompatible for in situ X-ray protein krystallografi har blitt designet, utviklet og testet av mange forskningsgrupper som konfronterer relaterte restriksjoner som oppstår fra arten av mikrofabrikasjonsmaterialer og deres interaksjonermed røntgenstråler 14,19,20,21,22,23. Fabrikasjonsmaterialene må være optisk gjennomsiktige, biologisk inerte og demonstrere høy gjennomsiktighet til røntgenstråling og et optimalt signal-til-støy-forhold under datainnsamling.
De fleste av krystalliseringsmetodene som brukes i konvensjonell proteinkrystallografi24,25 har også blitt implementert i mikrofluidisk skala11,14 for på chip krystallisering og in situ X-ray diffraksjon analyse. Enkelt, hybrid eller flerlags mikrofluidisk apparat som omfatter dampdiffusjon26,fordampning27,fri grensesnittdiffusjon (FID)28, mikrobatch26, eller til og med seeding29 har blitt brukt til å krystallisere løselige og membranproteiner. Høy gjennomstrømning screening og optimalisering av krystalliseringsforhold kan oppnås30,31 i godtbaserte 32, dråpebaserte33, eller ventil-aktiverte34 enheter. In situ Røntgendiffraksjonseksperimenter av utfordrende proteinmål ved romtemperatur er utført i mikrobrikker fabrikkert fra ulike materialer som PDMS (polydimetylsiloxane), COC (syklisk olefinkopolymer), PMMA (poly(metylmetakkrylat))21,22,26,28,29, grafen filmer23, Kapton35, epoxy lim6, eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 og materialenes gjennomsiktighet til røntgenstråling og deres bidrag til bakgrunnsstøy har blitt evaluert. Videre har mikrobrikker blitt designet for å pare in situ og serielle datainnsamlingsstrategier i et enkelt verktøy for røntgenproteinkrystallografieksperimenter ved synchrotron kilder23,35,36 og XFELs7.
Romtemperatur i situ datainnsamling er også implementert i ulike leveringsmetoder og enheter. For eksempel brukte Nogly et al.54 en lipidisk kubikkfase (LCP) injektor for å studere strukturen til den lysdrevne fotonpumpen bakteriorhodopsin (bR) av seriell femtosecond krystallografi (SFX) ved hjelp av en XFEL-kilde. Krystallstrukturen til bR ble løst til 2,3 Å-oppløsning, noe som viser kompatibiliteten til en LCP-injektor med tidsavklart seriell femtosecond krystallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 designet et høy tetthet multi-krystall rutenett, fabrikkert av en 100 eller 200 μm tykk polykarbonat plast med laser-cut hull i ulike størrelser. En ekstra 5 μm tykk polykarbonatfilm kan festes til den ene siden av rutenettet når du bruker enheten til å sitte- eller hengende krystalliseringseksperimenter. Dette høytetthetsgitteret kan brukes på flere måter, da krystaller kan lastes direkte på portene på enheten, eller krystaller kan dyrkes på enheten ved dampdiffusjon eller LCP-metoden. Videre kan rutenettet justeres i en standard magnetisk base og brukes til in situ X-ray datainnsamling ved kryogene eller romtemperaturforhold. Mer nylig utviklet Feiler et al.56 en prøveholder for makromolekylær in situ X-ray krystallografi ved kryogen og omgivelsestemperatur med minimal bakgrunnsstøybidrag. Spesielt består holderen av en plaststøtte, en gjennomsiktig COC-folie og en mikroporisk strukturert polyimidfolie. Den ble designet for å erstatte de vanlige deksellysbildene for å sette opp krystalliseringsdråper, samtidig som den tillater manipulering på stedet som ligand soaking, kompleks formasjon og kryogen beskyttelse uten å åpne krystalliseringsdråpen eller manuelt håndtere krystallene. Videre kan prøveholderen fjernes fra krystalliseringsplaten og plasseres på en magnetisk base for in situ-datainnsamling ved standard goniometerbaserte strålelinjer. For innsamling av omgivelsestemperaturer fjernes COC-folien før forsøket, og bare den 21 μm tykke polyimidefolien bidrar til bakgrunnsspperende, som i dette tilfellet er minimal. Disse eksemplene komponerer bare en liten brøkdel av den pågående forskningen og mangfoldet av allsidige mikrobrikker utviklet for røntgenproteinkrystallografi.
Dialyseproteinkrystalliseringsmetoden har imidlertid ikke vært mye innlemmet i mikrofluidier. Dialyse er en diffusjonsbasert metode som tar sikte på likevekt av bunnkonsentrasjon gjennom en halvgjennomtrengelig membran for å nærme seg den nominelle konsentrasjonen for proteinkrystallisering og muliggjør presis og reversibel kontroll over krystalliseringsforholdene24. Molecular Weight Cut-Off (MWCO) av den halvgjennomtrengelige dialysemembranen kan velges avhengig av makromolekylets molekylvekt og precipitants for å tillate diffusjon av små stupbraptmolekyler samtidig som makromolekylet av interesse beholdes. På grunn av reversibilitet av dialyseprosessen, kan den brukes i kombinasjon med temperaturkontroll for å koble fra og optimalisere kjerne- og krystallvekstuavhengig 37 for å undersøke fasediagrammer ved å endre den utløsende konsentrasjonen mens du bruker samme proteinprøve. Integreringen av membraner i mikrofluidics gjennomgås av de Jong et al.38 og case-studier i biologi implantering dialyse i mikrobrikker kan hovedsakelig listes opp i prøveforberedelse, konsentrasjon eller filtrering applikasjoner39,40,41,42 eller cellerelaterte studier43,44. Pervaporasjon gjennom PDMS ble brukt av Shim et al.37 for å studere kjernering og vekst av xylanase under ulike forhold. Vann gjennomsyret gjennom den 15 μm tykke PDMS-membranen inn i proteinreservoaret på mikrofluidisk enhet, og deretter endret proteinet og bunnkonsentrasjonen.
Protokollen utviklet av Junius et al.19,45 for fabrikasjon av en mikrofluidisk chip kompatibel for både on-chip protein krystallisering via mikroanalyse og in situ X-ray diffraksjon eksperimenter ved romtemperatur er presentert. Protokollen for enhetsfabrikasjonen er direkte inspirert av det banebrytende arbeidet som Studer og kollegaene12,46 for mikromønstrede klistremerker av fotoherdbare tiolenbaserte harpiks NOA 81 bygger inn kommersielt tilgjengelige membraner, ved hjelp av myk avtrykk litografi. En innovativ modifikasjon av metoden resulterte i mikrobrikker som gjør det mulig for bruk av mikroanalyse å nøyaktig overvåke og kontrollere eksperimentelle parametere for on-chip vekst av proteinkrystaller og samtidig utnytte fordelene med mikrofluidics, for eksempel redusert forbruk av proteinprøver per eksperiment ( 20 μL) for screening og optimalisering av krystalliseringsforhold ved å kartlegge temperaturutfellende konsentrasjonsfasediagrammervist 47. I dette arbeidet er en protokoll beskrevet for å produsere dialysemikrobrikker som omfatter regenerert cellulose (RC) dialysemembraner av forskjellige MWCO for å utføre krystalliseringsanalyser på chip og in situ X-ray diffraksjon datainnsamling. Materialene som består av mikrobrikkene har blitt evaluert for deres gjennomsiktighet til røntgen19, og enhetene kan settes rett foran røntgenstrålen for romtemperatur i situ diffraksjonseksperimenter, unntatt manuell håndtering og minimere nedbrytning av skjøre proteinkrystaller. I en case-studie ble høneegg-hvite lysozymkrystaller dyrket på chip via mikrodialyse som genererte en jevnt størrelse befolkning. Mikrobrikken ble deretter montert foran røntgenstrålen med en 3D-trykt støtte19 og komplett in situ diffraksjon datasett ble samlet inn ved romtemperatur fra flere, isomorfe krystaller, viser det høye potensialet og relevansen av chips for synchrotron seriekrystallografi studier av utfordrende makromolekylære mål.
En mikrofluidisk enhet er utviklet for on-chip proteinkrystallisering med mikrodialysemetoden og in situ X-ray diffraction eksperimenter ved romtemperatur. NOA 81 chips integrere RC dialyse membraner av noen MWCO for å bruke mikrodialyse for on-chip protein krystallisering kan fremstilles. Fabrikasjonsmaterialer med relativt høy røntgengjennomsiktighet ble brukt, noe som gjorde sjetongene kompatible for in situ proteinkrystallografi. Fabrikasjonsmaterialene som komponerer rommet for proteinkrystallisering av enheten (PMMA, Kapton, RC dialysemembran) ble evaluert for å generere lav bakgrunnsstøy. Spesielt observeres bakgrunnsstøyen som genereres av dialysebrikken hovedsakelig ved lav oppløsning (> 6 Å) og påvirker ikke behandlingen av høyoppløselige diffraksjonsdata av de store lysozymkrystallene som kreves for bestemmelse av proteinstruktur. Automatiseringen av datainnsamlingen forsterkes ved hjelp av en 3D-trykt støtte som kan monteres direkte i makromolekylære krystallografistrålelinjer og bære opptil tre mikrobrikker samtidig. På denne måten unngås manuell høsting og manipulering av de skjøre proteinkrys krystallene. Videre foregår datainnsamlingen ved romtemperatur, og unngår behovet for kryobeskyttelse som kan være relatert til konformasjonsendringer fra den innfødte proteinstrukturen2,3.
Bruken av mikroanalyse som en metode for å dyrke krystaller på brikken gjør det mulig å nøyaktig overvåke og kontrollere krystalliseringsprosessen. Som diskutert i innledningen, de fleste av de konvensjonelle protein krystallisering metoder har blitt implementert ved hjelp av mikrofluidiskeenheter 11,14. Fordelene med dialyse for proteinkrystallisering hadde imidlertid ennå ikke blitt fullt utnyttet på mikroskalaen. On-chip mikroanalyse gir mulighet til å studere fasediagrammer og utføre screening og optimalisering av krystalliseringsforhold med samme proteinprøve19. For prototypene som presenteres i dette arbeidet, er proteinforbruket per chip begrenset ned til 0,1 eller 0,3 μL. Basert på det eksperimentelle arbeidet så langt, kommer de mest kritiske trinnene i protokollen ikke fra chipsfabrikasjonsprosedyren, men fra krystalliseringsprosessen. Fabrikasjonsprotokollen inneholder mange trinn, men det er enkelt og muliggjør fabrikasjon av mange enheter (20 til 30 chips) på en enkelt dag i det rene rommet, med relativt rimelige materialer. Imidlertid kan krystallisering av proteiner på chip være en delikat prosedyre på grunn av den iboende stokastiske natur kjernering og krystallvekst, spesielt i mikroskalaen. En case-studie er beskrevet, hvor veletablerte forhold ble brukt til krystallisering av lysozym som ga robuste, veldefinerte krystaller egnet for in situ X-ray diffraksjon datainnsamling. Likevel kan det oppstå vanskeligheter ved bruk av mer utfordrende proteinmål, som membranproteiner, hvor krystalliseringsmediet er mye mer komplisert, fasediagrammer er ikke kjente og velfnende krystalliseringsforhold er ennå ikke godt etablert. Dialysebrikken gir mulighet til å overgå disse vanskelighetene og studere fasediagrammene på chip, uten å kaste den verdifulle og ofte kostbare proteinprøven, ved bare å utveksle krystalliseringsløsningen i mikrofluidisk kanal.
Allsidigheten til mikrofluidiske enheter stammer fra å utnytte mikrodialyse for on-chip proteinkrystallisering for å reversibelt kontrollere krystalliseringsforhold og kartkonsentrasjon og temperatur varierte fasediagrammer ved hjelp av lavt proteinvolum. Videre er enheten kompatibel med in situ X-ray diffraksjon eksperimenter og prototyping av enhetene er billig og rask. Tallrike, isomorfe krystaller av løselige og membranproteiner (i forberedelse) kan dyrkes på chip, og det forventes at alle disse funksjonene kan benyttes til serielle røntgenkrystallografistudier av utfordrende proteinmål ved synchrotron og XFEL-anlegg. Til slutt, utføre on-chip og in situ tid-løst studier er en fremtidig mulighet som kan være av betydelig interesse for det krystallografiske samfunnet. Derfor, ved å dyrke krystaller på dialysebrikken og introdusere reagensene i mikrofluidkanalen, enten manuelt (ved hjelp av en sprøyte) eller automatisk (med et trykkkontrollvæskesystem eller en sprøytepumpe), vil fremtidig innsats fokusere på å bevise at mikrofluidiske chips kan brukes til å utløse tidsløste eksperimenter på synchrotron beamlines.
The authors have nothing to disclose.
MBS anerkjenner støtte fra MI / CNRS under kontrakten Instrumentering på grensene 2014-2015. NJ anerkjenner CEA’s International Doctoral Research Program (Irtelis) for PhD Fellowship. MBS og SJ anerkjenner støtte fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale nummer 722687. MBS, SJ og NJ takker LIPhy (UGA) for det rene romet for mikrofabrikasjonseksperimenter. IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA).
3 in wafer | Silicon Materials Inc. | Silicon wafer | |
Centrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
CleWin 3.0 | WieWeb software | Designing software | |
Epoxy glue | Devcon | 5 minutes epoxy glue | |
Fluidic connectors | Cluzeau Info Lab | N-333 | NanoPort kit for 1/16" OD tubing |
Hen egg-white lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | Lyophilized protein powder |
High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Dow Corning high-vacuum silicone grease |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191 | Silane, chemical |
Hot plate | Sawatec | HP-200-Z-HMDS BM | Hot plate |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | Solvent | |
Kapton tape | DuPont | Polyimide tape | |
Mask aligner | SUSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner, UV source |
Membrane filter | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
Microscope glass slide | Fisher Scientific | 12164682 | 3 x 1 in glass slides |
NOA81 | Norland Products Inc. | NOA81 | Photocurable resin |
Oven | Memmert | Oven | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | Chemical |
Petri dish | Sigma-Aldrich | P5731 | 100 x 15 mm |
PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
Plasma equipment | Diener Electronic | ZEPTO | Plasma treatment |
PMMA | Goodfellow | 137-745-63 | PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness |
Pressure driven system | Elveflow | OB1 MK3+ | Pressure/vacuum controller |
PTFE tubing | Elveflow/Darwin microfluidics | LVF-KTU-15 | PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID |
RC dialysis membrane | Spectra/Por | Various MWCOs | |
Scalpel | Swann-Morton | Carbon steel surgical blades | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Solidworks | Dassault Systemes | 3D-CAD designing software | |
Spin coater | SPS | Spin150 | Wafer spinner |
SU-8 3000 series | MicroChem Corp. | SU-8 3050 | Photoresist |
Syringe | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok syringe |
UV crosslinker | Uvitec | CL-508 | UV crosslinker |