Detta dokument beskriver tillverkningsprotokollet för mikrofluidiska chips som utvecklats för proteinkristallisering på chip med dialysmetoden och in situ-röntgendiffraktionsexperiment. Mikrofabriceringsprocessen gör det möjligt att integrera ett semipermeabelt regenererat cellulosadialysmembran med eventuell molekylviktsavskärning, mellan två lager av chipet.
Detta protokoll beskriver tillverkningen av reproducerbara och billiga mikrofluidiska anordningar som täcker hela rörledningen för kristallisering av proteiner på chip med dialysmetoden och möjliggör in situ enkristall- eller seriekristallografiexperiment vid rumstemperatur. Protokollet beskriver tillverkningsprocessen för mikrochips, manipulering av kristalliseringsexperimenten på chip och behandlingen av in situ insamlade röntgendiffraktionsdata för strukturell klargörande av proteinprovet. Huvuddragen i detta mikrofabriceringsförfarande ligger på integrationen av ett kommersiellt tillgängligt, halvgenomsläppligt regenererat cellulosadialysmembran mellan två lager av chipet. Molekylviktsavskärningen av det inbäddade membranet varierar beroende på makromolekylens och utfällningsmediernas molekylvikt. Enheten utnyttjar fördelarna med mikrofluidisk teknik, såsom användning av minimala volymer av prover (<1 μL) och finjustering över transportfenomen. Chippet kopplade dem till dialysmetoden, vilket gav exakt och reversibel kontroll över kristalliseringsprocessen och kan användas för att undersöka fasdiagram över proteiner på mikroliterskalan. Enheten är mönstrad med hjälp av ett fotoboterbart tiolenbaserat harts med mjuk avtryckslitografi på ett optiskt transparent polymer substrat. Dessutom utvärderades bakgrundsspridningen av materialen som komponerade mikrochipsen och genererade bakgrundsljud, vilket gjorde chipet kompatibelt för in situ-röntgendiffraktionsexperiment. När proteinkristaller har odlats på chip upp till en tillräcklig storlek och populationsuniformitet kan mikrochipsen monteras direkt framför röntgenstrålen med hjälp av en 3D-utskriven hållare. Detta tillvägagångssätt tar itu med de utmaningar som ökar från användningen av kryoprotekter och manuell skörd i konventionella proteinkristallografiexperiment på ett enkelt och billigt sätt. Kompletta röntgendiffraktionsdatauppsättningar från flera isomorfa lysozymekristaller odlade på chip samlades in vid rumstemperatur för strukturbestämning.
Att belysa den tredimensionella (3D) strukturen hos biologiska makromolekyler är en ouppenbar strävan i strukturbiologi där röntgenkristallografi fortfarande är den huvudsakliga undersökningstekniken. Den tillämpas för att riva upp de strukturella detaljerna i komplexa makromolekyler, såsom proteiner, och syftar till att underlätta förståelsen av deras verkningsmekanismer och deras deltagande i olika biologiska funktioner. Kraftfulla röntgenkällor vid synkrotroner och röntgenfria elektronlasrar (XFELs) ger alla verktyg som krävs för en djupare inblick i proteinernas struktur vid nära atomupplösning. Trots de fördelar som följer med användningen av röntgenstrålar för strukturella studier finns det inneboende begränsningar för röntgenstrålning och själva kristalliseringsprocessen. Strålningsskador som orsakas av högt röntgenflöde och långa exponeringstider för proteinkristallen framför röntgenstrålen är restriktiva parametrar som kristallografer måste överträffa med kryogenkylning 1. Att hitta de optimala kryokylningsförhållandena kan dock vara mödosamt eftersom konformationsförändringar från den inhemska proteinstrukturen eller artefakterna kan döljas2,3. Dessutom visar nyligen genomförda studier att utföra diffraktionsexperiment vid rumstemperatur leder till lägre specifika strålningsskador4. En annan flaskhals i strukturbiologin är förvärvet av väldriffande kristaller med en tillräcklig storlek5. Små kristaller är lättare att producera, särskilt när det gäller membranproteiner, men är mer mottagliga för strålningsskador även under kryokylningsförhållanden eftersom en hög stråldos måste riktas i en mindre volym jämfört med fallet med större proteinkristaller6. Den nya metoden medseriekristallografi 7,8 vid synkrotroner och XFELs kan kringgå begränsningarna av strålningsskador och samtidigt utnyttja mindre kristaller (200 nm till 2 μm)7 genom att slå samman datauppsättningar från flera, isomorfa och slumpmässigt orienterade proteinkristaller och dra nytta av tillhörande tekniska framsteg som femtosekviska pulser, kortare exponeringstider och mikrofokuserade röntgenstrålar5,7,9,10.
Mikrofluidisk teknik är värdefull för röntgenkristallografi, som uppvisar många fördelar för kristalliseringen av biologiska makromolekyler och deras strukturella undersökning. Att genomföra kristalliseringsexperiment i mikrofluidiska enheter kräver små volymer proteinprov, vilket begränsar produktionskostnaden för dessa högt värderade biomakromolekyler och underlättar screening och optimering av många kristalliseringsförhållanden. Dessutom möjliggör det inneboende förhållandet mellan stora ytor och volym vid mikrofluidisk skala och diffusionsbegränsade transportfenomen fin kontroll över flöden och temperatur- eller koncentrationsgradienter11,12,13,14, vilket gör mikrofluidiska anordningar lämpliga för odling av kristaller av enhetlig storlek och utforskande fasdiagram15,16,17,18,19. Dessutom uppvisar mikrofluidiska verktyg en särskiljande potential att ta itu med ett annat hinder i proteinkristallografi, som är provleveransen, och behovet av att hantera och skörda proteinkristaller innan de används för röntgendiffraktionsexperiment. Metoden för röntgenkristallografi på chip och in situ eliminerar kristallmanipulationen och den potentiella försämringen av kristallkvaliteten före datainsamlingen. Ett brett utbud av mikrofluidiska chips som är kompatibla för in situ-röntgenproteinkristallografi har utformats, utvecklats och testats av många forskargrupper som konfronterar de relaterade begränsningarna som följer av mikrotillverkningsmaterialens natur och deras interaktioner med röntgenstrålar14,19,20,21,22,23. Tillverkningsmaterialen måste vara optiskt transparenta, biologiskt inerta och uppvisa hög transparens mot röntgenstrålning och ett optimalt signal-till-brusförhållande under datainsamlingen.
De flesta kristalliseringsmetoder som tillämpas i konventionell proteinkristallografi24,25 har också implementerats på den mikrofluidiskaskalan 11,14 för på spånkristallisering och in situ X-ray diffraktionsanalys. Enkel, hybrid eller flerskiktad mikrofluidisk apparat som innehåller ångdiffusion26, avdunstning27, gratis gränssnittsdiffusion (FID)28, mikrobatch26, eller till och medsådd 29 har använts för att kristallisera lösliga och membranproteiner. Screening med hög genomströmning och optimering av kristalliseringsförhållanden kanuppnås 30,31 ivälbaserad 32,droppbaserad33, eller ventil-aktiverade34 enheter. In situ Röntgendiffraktionsexperiment av utmanande proteinmål vid rumstemperatur har utförts i mikrochips tillverkade av olika material som PDMS (polydimethylsiloxane), COC (cyklisk olefin copolymer), PMMA (poly(metylmetakrylat))21,22,26,28,29, grafenfilmer23, Kapton35, epoxilim6, eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 och materialens transparens för röntgenstrålning och deras bidrag till bakgrundsljud har utvärderats. Dessutom har mikrochips utformats för att koppla in situ och seriella datainsamlingsstrategier i ett enda verktyg för röntgenproteinkristallografiexperiment vid synkrotronkällor23,35,36 och XFELs7.
Rumstemperatur på plats datainsamling har också implementerats i olika leveransmetoder och enheter. Till exempel använde Nogly et al.54 en lipidisk kubikfasinjektor (LCP) för att studera strukturen hos den ljusdrivna fotonpumpen bacteriorhodopsin (bR) genom seriell femtosekonkristallografi (SFX) med hjälp av en XFEL-källa. Kristallstrukturen i bR löstes till 2,3 Å-upplösning, vilket visar kompatibiliteten hos en LCP-injektor med tidsupplöst seriell femtosekonkristallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 konstruerade ett multikristallnät med hög densitet, tillverkat av en 100 eller 200 μm tjock polykarbonatplast med laserskurna hål av olika storlekar. Ytterligare 5 μm tjock polykarbonatfilm kan fästas på ena sidan av gallret när du använder enheten för sittande eller hängande kristalliseringsexperiment. Detta rutnät med hög densitet kan användas på flera sätt eftersom kristaller kan laddas direkt på enhetens portar eller kristaller kan odlas på enheten genom ångdiffusion eller LCP-metoden. Dessutom kan nätet justeras i en standardmagnetisk bas och användas för insamling av röntgendata på plats vid kryogena förhållanden eller rumstemperaturförhållanden. På senare tid utvecklade Feiler et al.56 en provhållare för makromolekylär in situ-röntgenkristallografi vid kryogen och omgivningstemperatur med minimalt bakgrundsljudbidrag. Specifikt består hållaren av ett plaststöd, en transparent COC-folie och en mikroporös strukturerad polyimidfolie. Det utformades för att ersätta de vanliga täckbilderna för att ställa in kristalliseringsdroppar, samtidigt som man tillåter manipulering på plats som ligand blötläggning, komplex formation och kryogent skydd utan att öppna kristalliseringsdropp eller manuellt hantera kristallerna. Dessutom kan provhållaren avlägsnas från kristalliseringsplattan och placeras på en magnetisk bas för in situ-datainsamling vid standard goniometerbaserade strållinjer. För datainsamling av omgivningstemperatur avlägsnas COC-folien före experimentet och endast den 21 μm tjocka polyimidfolien bidrar till bakgrundsspridning, vilket i detta fall är minimalt. Dessa exempel utgör bara en liten del av den pågående forskningen och den mängd mångsidiga mikrochips som utvecklats för röntgenproteinkristallografi.
Dialysproteinkristalliseringsmetoden har dock inte införlivats i stor utsträckning inom mikrofluidik. Dialys är en diffusionsbaserad metod som syftar till jämvikt av utfällningskoncentrationen genom ett halvgenomsläppligt membran för att närma sig den nominella koncentrationen för proteinkristallisering och möjliggör exakt och reversibel kontroll över kristalliseringsförhållandena24. Den molekylära viktavskärningen (MWCO) i det halvgenomsläppliga dialysmembranet kan väljas beroende på makromolekylens och utfällningsfaktorernas molekylvikt för att möjliggöra diffusion av små utfällningsmolekyler samtidigt som makromolekylen bibehålls av intresse. På grund av dialysprocessens reversibilitet kan den användas i kombination med temperaturreglering för att frikoppla och optimera nukleation och kristalltillväxtoberoende av 37 för att undersöka fasdiagram genom att ändra den utfällande koncentrationen samtidigt som samma proteinprov används. Integrationen av membran i mikrofluidik granskas av de Jong et al.38 och fallstudierna i biologi implantering av dialys i mikrochips kan huvudsakligen listas i provberednings-, koncentrations- eller filtreringsapplikationer39,40,41,42 eller cellrelaterade studier43,44. Pervaporation genom PDMS användes av Shim et al.37 för att studera kärnan och tillväxten av xylanas under olika förhållanden. Vatten genomborrades genom det 15 μm tjocka PDMS-membranet i proteinbehållaren på den mikrofluidiska enheten och ändrade därefter protein- och utfällningskoncentrationen.
Protokollet som utvecklats av Junius et al.19,45 för tillverkning av ett mikrofluidiskt chip kompatibelt för både proteinkristallisering på chip via mikrodialys och in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur presenteras. Protokollet för enhetstillverkningen är direkt inspirerat av det banbrytande arbete som utförs av Studer och medarbetare12,46 för mikromönstrade klistermärken av fotohärdande tiokonenbaserade harts NOA 81 som bäddar in kommersiellt tillgängliga membran med hjälp av mjuk avtryckslitografi. En innovativ modifiering av metoden resulterade i mikrochips som gjorde det möjligt att använda mikrodialys för att noggrant övervaka och kontrollera de experimentella parametrarna för proteinkristallers tillväxt på chip och samtidigt utnyttja fördelarna med mikrofluidik, såsom minskad konsumtion av proteinprover per experiment (20 μL) för screening och optimering av kristalliseringsförhållanden genom kartläggning av temperaturutfällande koncentrationsfasdiagram47. I detta arbete beskrivs ett protokoll för att producera dialysmikrochips som innehåller regenererade cellulosa (RC) dialysmembran av olika MWCO för att utföra kristalliseringsanalyser på chip och in situ X-ray diffraktionsdatainsamling. Materialen som består av mikrochipsen har utvärderats för deras transparens för röntgenstrålar19 och apparaterna kan ställas in direkt framför röntgenstrålen för rumstemperatur i situ diffraktionsexperiment, med undantag för manuell hantering och minimering av nedbrytningen av ömtåliga proteinkristaller. I en fallstudie odlades hen äggvita lysozyme kristaller på chip via mikrodialys som genererar en enhetlig storlek befolkning. Mikrochipet monterades sedan framför röntgenstrålen med ett 3D-printat stöd19 och kompletta in situ diffraktionsdatauppsättningar samlades in vid rumstemperatur från flera isomorfa kristaller, vilket visar chipsens höga potential och relevans för synkrotron seriell kristallografi studier av utmanande makromolekylära mål.
En mikrofluidisk enhet har utvecklats för proteinkristallisering på chip med mikrodialysmetoden och in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur. NOA 81-chips som integrerar RC-dialysmembran i någon MWCO för att använda mikrodialys för kristallisering av protein på chip kan tillverkas. Tillverkningsmaterial med relativt hög röntgentransparens användes, vilket gjorde chipsen kompatibla för in situ-proteinkristallografi. De tillverkningsmaterial som komponerar facket för proteinkristallisering av enheten (PMMA, Kapton, RC dialysmembran) utvärderades för att generera lågt bakgrundsljud. Specifikt observeras bakgrundsljudet som genereras av dialyschipet främst vid låg upplösning (> 6 Å) och påverkar inte behandlingen av högupplösta diffraktionsdata för de stora lysozymekristaller som krävs för bestämning av proteinstrukturer. Automatiseringen av datainsamlingen förstärks med hjälp av ett 3D-printat stöd som kan monteras direkt i makromolekylära kristallografistrålar och bära upp till tre mikrochips samtidigt. På så sätt undviks manuell skörd och manipulering av de bräckliga proteinkristallerna. Dessutom sker datainsamlingen vid rumstemperatur, vilket undviker behovet av kryoprotection som kan relateras till konformationsförändringar från den inhemska proteinstrukturen2,3.
Användningen av mikrodialys som metod för att odla kristaller på chip gör det möjligt att noggrant övervaka och kontrollera kristalliseringsprocessen. Som diskuterats i introduktionen har de flesta av de konventionella proteinkristalliseringsmetoderna implementerats med hjälp av mikrofluidiskaenheter 11,14. Fördelarna med dialys för proteinkristallisering hade dock ännu inte utnyttjats fullt ut i mikroskalan. Mikrodialys på chip ger möjlighet att studera fasdiagram och utföra screening och optimering av kristalliseringsförhållanden med samma proteinprov19. För de prototyper som presenteras i detta arbete är proteinförbrukningen per chip begränsad ner till 0,1 eller 0,3 μL. Baserat på det experimentella arbetet hittills härrör de mest kritiska stegen i protokollet inte från chipsens tillverkningsprocedur utan från kristalliseringsprocessen. Tillverkningsprotokollet innehåller många steg men det är enkelt och möjliggör tillverkning av många enheter (20 till 30 chips) på en enda dag i det rena rummet, med relativt billiga material. Kristalliseringen på chip av proteiner kan dock vara ett känsligt förfarande på grund av den inneboende stokastiska karaktären hos nukleation och kristalltillväxt, särskilt i mikroskalan. En fallstudie har beskrivits, där väletablerade villkor användes för kristallisering av lysozyme som gav robusta, väldefinierade kristaller lämpliga för in situ X-ray diffraktion data insamling. Ändå kan svårigheter uppstå genom användning av mer utmanande proteinmål, såsom membranproteiner, där kristalliseringsmediet är mycket mer komplicerat, fasdiagram är inte kända och väl fungerande kristalliseringsförhållanden ännu inte är väletablerade. Dialyschipet ger möjlighet att överträffa dessa svårigheter och studiefasdiagram på chip, utan att kassera det värdefulla och ofta kostsamma proteinprovet, genom att bara byta kristalliseringslösningen inom den mikrofluidiska kanalen.
Mångsidigheten hos mikrofluidiska enheter härrör från att utnyttja mikrodialys för proteinkristallisering på chip för att reversibelt kontrollera kristalliseringsförhållanden och kartlägga koncentration och temperatur varierade fasdiagram med låg proteinvolym. Dessutom är enheten kompatibel med in situ-röntgendiffraktionsexperiment och prototyperna av enheterna är billiga och snabba. Många isomorfa kristaller av lösliga och membranproteiner (som beredning) kan odlas på chip och det förväntas att alla dessa funktioner kan användas för seriella röntgenkristallografistudier av utmanande proteinmål vid synkrotron- och röntgenanläggningar. Slutligen, att utföra on-chip och in situ tidsavgjorda studier är en framtida möjlighet som kan vara av betydande intresse för det kristallografiska samhället. Genom att odla kristaller på dialyschipet och introducera reagenserna i den mikrofluidiska kanalen, antingen manuellt (med en spruta) eller automatiskt (med ett tryckkontrollvätskesystem eller en sprutpump), kommer framtida ansträngningar att fokusera på att bevisa att mikrofluidchipsen framgångsrikt kan användas för att utlösa tidsupplösta experiment på synkrotronstrålar.
The authors have nothing to disclose.
MBS bekräftar stödet från MI / CNRS enligt kontraktet Instrumentation vid gränserna 2014-2015. NJ uppmärksammar CEA:s internationella forskarutbildning (Irtelis) för forskarstipendiet. MBS och SJ erkänner finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtal nummer 722687. MBS, SJ och NJ tackar LIPhy (UGA) för renrumsanläggningen för mikrotillverkningsexperiment. IBS erkänner integrationen i Grenobles tvärvetenskapliga forskningsinstitut (IRIG, CEA).
3 in wafer | Silicon Materials Inc. | Silicon wafer | |
Centrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
CleWin 3.0 | WieWeb software | Designing software | |
Epoxy glue | Devcon | 5 minutes epoxy glue | |
Fluidic connectors | Cluzeau Info Lab | N-333 | NanoPort kit for 1/16" OD tubing |
Hen egg-white lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | Lyophilized protein powder |
High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Dow Corning high-vacuum silicone grease |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191 | Silane, chemical |
Hot plate | Sawatec | HP-200-Z-HMDS BM | Hot plate |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | Solvent | |
Kapton tape | DuPont | Polyimide tape | |
Mask aligner | SUSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner, UV source |
Membrane filter | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
Microscope glass slide | Fisher Scientific | 12164682 | 3 x 1 in glass slides |
NOA81 | Norland Products Inc. | NOA81 | Photocurable resin |
Oven | Memmert | Oven | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | Chemical |
Petri dish | Sigma-Aldrich | P5731 | 100 x 15 mm |
PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
Plasma equipment | Diener Electronic | ZEPTO | Plasma treatment |
PMMA | Goodfellow | 137-745-63 | PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness |
Pressure driven system | Elveflow | OB1 MK3+ | Pressure/vacuum controller |
PTFE tubing | Elveflow/Darwin microfluidics | LVF-KTU-15 | PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID |
RC dialysis membrane | Spectra/Por | Various MWCOs | |
Scalpel | Swann-Morton | Carbon steel surgical blades | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Solidworks | Dassault Systemes | 3D-CAD designing software | |
Spin coater | SPS | Spin150 | Wafer spinner |
SU-8 3000 series | MicroChem Corp. | SU-8 3050 | Photoresist |
Syringe | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok syringe |
UV crosslinker | Uvitec | CL-508 | UV crosslinker |