वायलेट-उत्तेजित सेल-पारमी योग्य डीएनए बाइंडिंग डाई का उपयोग करके मुरीन शुक्राणुओं की कोशिकाओं का अलगाव
Summary
यहां हम वयस्क माउस टेस्ट से लाइव मेयोटिक और पोस्ट-मेयोटिक रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और कुशल विधि पेश करते हैं। एक कम साइटोटॉक्सिकिटी, वायलेट-उत्तेजित डीएनए बाध्यकारी डाई और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग करके, कोई भी कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक समृद्ध शुक्राणुओं की कोशिका आबादी को अलग कर सकता है।
Abstract
मेयोसिस और शुक्राणुओं के अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए मेइओटिक शुक्राणुओं का अलगाव आवश्यक है। यद्यपि फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के संयोजन में होचस्ट 33342 धुंधला का उपयोग करके स्थापित सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल हैं, लेकिन इसके लिए पराबैंगनी लेजर से लैस सेल सॉरर्स की आवश्यकता होती है। यहां हम डाइनसाइकिल वायलेट (डीसीवी) दाग का उपयोग करके एक सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो एक कम साइटोटॉक्सिकिटी डीएनए बाइंडिंग डाई संरचनात्मक रूप से होचस्ट 33342 के समान है। डीसीवी दोनों पराबैंगनी और बैंगनी लेजर, जो उपकरण पसंद के लचीलेपन में सुधार, एक सेल सॉर्टर एक पराबैंगनी लेजर से सुसज्जित नहीं सहित से उत्साहित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक मेइटिक प्रोफेन I में तीन लाइव-सेल सबपॉलेशन को अलग कर सकता है, जिसमें लेप्टोटीन/जाइगोटेन, पैचिटीन और डिप्लोटीन शुक्राणु, साथ ही पोस्ट-मेयोटिक राउंड स्पर्मेटिक्स शामिल हैं। हम माउस टेस्ट से एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं। कुल मिलाकर, प्रक्रिया को पूरा करने के लिए थोड़े समय की आवश्यकता होती है (आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के आधार पर 4-5 घंटे), जो कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है।
Introduction
शुक्राणुएटोजेनेसिस एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें शुक्राणुओं की एक छोटी आबादी स्टेम कोशिकाओं के वयस्क जीवन में बड़ी संख्या में शुक्राणुओं का निरंतर उत्पादन बनाए रखती है1,2. शुक्राणुओं के दौरान, गतिशील क्रोमेटिन रीमॉडलिंग तब होती है जब शुक्राणुओं की कोशिकाएं हैप्लॉयडस्पर्मेटिक्स3,4,5का उत्पादन करने के लिए मेयोसिस से गुजरती हैं। आणविक जांच के लिए मेयोटिक शुक्राणुओं का अलगाव आवश्यक है, और मेइओटिक शुक्राणुओं को अलग करने के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण स्थापित किए गए हैं, जिनमें तलछट-आधारित पृथक्करण6,7 और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,17शामिल हैं। हालांकि, इन तरीकों की तकनीकी सीमाएं हैं। जबकि तलछट आधारित पृथक्करण से बड़ी संख्या में कोशिकाएं5,6,7होती हैं, यह श्रम प्रधान है। स्थापित एफएएफएस-आधारित विधि डीएनए सामग्री और प्रकाश बिखरने वाले गुणों के आधार पर मेयोटिक शुक्राणुओं को अलग करने के लिए होचस्ट 33342 (हो342) का उपयोग करती है और इसके लिए पराबैंगनी (यूवी)लेजर8, 9, 10,11से लैस FACS सेल सॉर्टर्स की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक एफएस-आधारित विधियों के लिए ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की आवश्यकता होती है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन, शुक्राणुओं के सिंक्रोनाइजेशन12,या सेल निर्धारण और एंटीबॉडी लेबलिंग को व्यक्त करती हैं जो जीवित कोशिकाओं के अलगाव के साथ संगत नहीं है13। जबकि सेल-पारमी डीएनए बाइंडिंग डाई, डाइनसाइकिल ग्रीन स्टेन14, 15,16,17का उपयोग करके एक और वैकल्पिक विधि है, किशोर टेस्टिस से शुक्राणुओं की कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस विधि की सिफारिश की जाती है। इसलिए, लाइव मेयोटिक स्पर्मेटोसाइट्स के लिए एक सरल और मजबूत अलगाव विधि विकसित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जिसे किसी भी उम्र के किसी भी माउस तनाव पर लागू किया जा सकता है और जिसे किसी भी FACS सेल सॉर्टर का उपयोग करके किया जा सकता है।
यहां हम डाईसाइकिल वायलेट (डीसीवी) दाग का उपयोग करके इस तरह के लंबे समय से मांग किए गए सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। डीसीवी एक कम साइटोटॉक्सिकिटी, सेल-पारगम्य डीएनए बाइंडिंग डाई संरचनात्मक रूप से Ho342 के समान है, लेकिन एक उत्तेजन स्पेक्ट्रम के साथ वायलेट रेंज18की ओर स्थानांतरित कर दिया। इसके अलावा डीसीवी के पास डीसीजी की तुलना में व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है । इस प्रकार, यह यूवी और वायलेट लेजर दोनों से उत्साहित हो सकता है, जो उपकरणों के लचीलेपन में सुधार करता है, जिससे यूवी लेजर से लैस एक FACS सेल सॉर्टर का उपयोग होता है। यहां प्रस्तुत डीसीवी प्रोटोकॉल DCV ब्लू और डीसीवी लाल के साथ दो आयामी जुदाई का उपयोग करता है, Ho342 प्रोटोकॉल के लाभ की नकल उतार । इस लाभ के साथ, हमारा डीसीवी प्रोटोकॉल हमें वयस्क टेस्टिस से अत्यधिक समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है। हम एक माउस (दो टेस्ट से) के वयस्क माउस टेस्ट से जीवित शुक्राणुओं की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विस्तृत गेटिंग प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम माउस टेस्ट से एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक कुशल और त्वरित प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं जिसका उपयोग इस सेल अलगाव के लिए किया जा सकता है। प्रक्रिया को पूरा करने के लिए एक कम समय की आवश्यकता है (एकल सेल निलंबन की तैयारी – 1 घंटे, डाई धुंधला – 30 मिनट, और सेल छंटाई – 2-3 घंटे: कुल – 4-5 घंटे आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के आधार पर; चित्रा 1)। सेल अलगाव के बाद, आरएनए-सेक्यू, ATAC-seq, ChIP-seq, और सेल संस्कृति सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला पूरी की जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एक वयस्क पुरुष माउस से शुक्राणुओं और शुक्राणुओं की उपआबादी को अलग करने के लिए एक व्यावहारिक और सरल प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इस प्रोटोकॉल की पुन: उत्पन्न क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, कुछ महत्वप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम नामकावा, योशिदा और माजावा प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं; पांडुलिपि के संपादन के लिए केटी गेरहार्ट; एच1टी एंटीबॉडी साझा करने के लिए मैरी एन हंडेल, सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर (सीसीएचएमसी) रिसर्च फ्लो साइटोमेट्री कोर को एनआईएच S10OD023410 द्वारा समर्थित FACS उपकरण साझा करने के लिए; वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-सहायता (KAKENHI; 17K07424) टीएन; लालोर फाउंडेशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप एएस; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) से एसवाई; अज़ाबू विश्वविद्यालय अनुसंधान सेवा प्रभाग द्वारा अनुसंधान परियोजना अनुदान, शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MEXT) निजी विश्वविद्यालय अनुसंधान ब्रांडिंग परियोजना (2016-2019) के लिए समर्थित कार्यक्रम, अनुसंधान गतिविधि स्टार्ट-अप (19K21196), टेकडा साइंस फाउंडेशन (2019) और यूहारा मेमोरियल फाउंडेशन रिसर्च इंसेंटिव ग्रांट (2018) के लिए एस.M.; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R01 GM122776 S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
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