गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक संस्कृति
Summary
गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के इन विट्रो संस्कृति और डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट पर पोषण सीढ़ी-चरण आहार का प्रभाव प्रस्तुत किया गया है। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को सात दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और स्टेरॉयड, साइटोकिन्स और कूप चरणों का मूल्यांकन किया गया था। सीढ़ी-कदम आहार उपचार ने स्टेरॉयडोजेनेसिस में वृद्धि की थी जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति में कूप प्रगति हुई थी।
Abstract
आदिम से एंट्रल चरण तक कूप विकास डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के भीतर एक गतिशील प्रक्रिया है, जिसमें दैहिक कोशिकाओं और क्यूमुलस सेल-ओसाइट संचार से अंतःस्रावी और पैराक्राइन कारक शामिल हैं। डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट के बारे में बहुत कम जाना जाता है और आसपास के परिवेश में उत्पादित साइटोकिन्स और स्टेरॉयड कूप प्रगति या गिरफ्तारी को कैसे प्रभावित करते हैं। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था की इन विट्रो संस्कृति रोम को एक सामान्यीकृत वातावरण में विकसित करने में सक्षम बनाती है जो आसन्न स्ट्रोमा द्वारा समर्थित रहती है। हमारा उद्देश्य बोवाइन डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के इन विट्रो संस्कृति के माध्यम से डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट (कूप विकास, स्टेरॉयड, और साइटोकाइन उत्पादन) पर पोषण संबंधी सीढ़ी-चरण आहार के प्रभाव को निर्धारित करना था। इसे पूरा करने के लिए, डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल टुकड़ों को यौवन से पहले दो अलग-अलग पोषण संबंधी रूप से विकसित योजनाओं से गुजरने वाले बछड़ों से हटा दिया गया था: नियंत्रण (पारंपरिक पोषण विकास) और सीढ़ी-चरण (विकास के दौरान खिलाने और प्रतिबंध) जो लगभग 0.5-1 मिमी3 टुकड़ों में काट दिए गए थे। इन टुकड़ों को बाद में धोने की एक श्रृंखला के माध्यम से पारित किया गया था और एक ऊतक संस्कृति सम्मिलित पर तैनात किया गया था जो वेमाउथ के संस्कृति माध्यम से युक्त एक अच्छी तरह से सेट किया गया है। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था दैनिक संस्कृति मीडिया परिवर्तन के साथ 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग को अतिरिक्त उपचार के बिना पोषण और संस्कृति के प्रभाव के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए संस्कृति से पहले और बाद में कूप चरण परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। कॉर्टेक्स संस्कृति माध्यम को स्टेरॉयड, स्टेरॉयड मेटाबोलाइट्स और साइटोकिन्स को मापने के लिए दिनों में पूल किया गया था। डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में स्टेरॉयड हार्मोन में वृद्धि के लिए प्रवृत्तियां थीं जो सीढ़ी-चरण बनाम नियंत्रण डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों में कूप प्रगति के लिए अनुमति देती थीं। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति तकनीक डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट की बेहतर समझ के लिए अनुमति देती है, और अंतःस्रावी स्राव में परिवर्तन विवो और इन विट्रो उपचार दोनों से कूप प्रगति और विकास को कैसे प्रभावित कर सकता है। यह संस्कृति विधि संभावित चिकित्सीय परीक्षण के लिए भी फायदेमंद साबित हो सकती है जो प्रजनन क्षमता को बढ़ावा देने के लिए महिलाओं में कूप प्रगति में सुधार कर सकती है।
Introduction
डिम्बग्रंथि प्रांतस्था अंडाशय की बाहरी परत का प्रतिनिधित्व करता है जहां कूप विकास होता है1. प्रारंभिक follicles, शुरू में विकास में गिरफ्तार किया गया, प्राथमिक, माध्यमिक बनने के लिए सक्रिय किया जाएगा, और फिर पैराक्राइन और गोनाडोट्रोपिन इनपुट1,2,3,4के आधार पर एंट्रल या तृतीयक follicles। अंडाशय के भीतर शारीरिक प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए, ऊतक संस्कृति को इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे एक नियंत्रित वातावरण को प्रयोगों का संचालन करने की अनुमति मिलती है। कई अध्ययनों ने सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकी, प्रजनन संरक्षण और डिम्बग्रंथि के कैंसर5,6,7में अनुसंधान के लिए डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति का उपयोग किया है। डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति ने प्रजनन विषाक्त पदार्थों की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में भी कार्य किया है जो डिम्बग्रंथि के स्वास्थ्य और प्रजनन विकारों के एटियलजि को नुकसान पहुंचाते हैं जैसे कि पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम (पीसीओएस)8,9,10,11। इस प्रकार, यह संस्कृति प्रणाली विशिष्टताओं की एक विस्तृत सरणी पर लागू होती है।
कृन्तकों में, पूरे भ्रूण या प्रसवकालीन गोनाड्स का उपयोग प्रजनन जीव विज्ञान प्रयोगों में किया गया है12,13,14,15। हालांकि, बड़े घरेलू पशुधन से गोनाड्स को उनके बड़े आकार और संभावित अध: पतन के कारण पूरे अंगों के रूप में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। इसलिए, गोजातीय, और गैर-मानव प्राइमेट डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को छोटे टुकड़ों में काटा जाता है16,17,18। कई अध्ययनों ने घरेलू पशुधन और गैर-मानव प्राइमेट्स1, 17, 18, 19में आदिम कूप दीक्षा में विभिन्न विकास कारकों(ओं)का अध्ययन करने के लिए छोटे डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को सुसंस्कृत किया है। डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स संस्कृति के उपयोग ने 7दिनोंके लिए सुसंस्कृत गोजातीय और प्राइमेट कॉर्टिकल टुकड़ों के लिए सीरम की अनुपस्थिति में आदिम कूप दीक्षा का भी प्रदर्शन किया है। 2006 में यांग और फॉर्च्यून ने 10 दिनों में टेस्टोस्टेरोन खुराक की एक श्रृंखला के साथ भ्रूण डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम का इलाज किया और देखा कि टेस्टोस्टेरोन की 10-7 एम एकाग्रता ने कूप भर्ती, अस्तित्व और प्रारंभिक चरण के रोमकीप्रगति में वृद्धि की। 2007 में, गोजातीय भ्रूण (गर्भावस्था के 5-8 महीने) से डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, यांग और फॉर्च्यून ने प्राथमिक से माध्यमिक कूप संक्रमण21में संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर ए (वीईजीएफए) के लिए एक भूमिका की सूचना दी। इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला ने डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया है कि वीईजीएफए आइसोफोर्म (एंजियोजेनिक, एंटीएंजियोजेनिक, और एक संयोजन) काइनेज डोमेन रिसेप्टर (केडीआर) के माध्यम से विभिन्न सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों को विनियमित कर सकते हैं, जो मुख्य सिग्नल ट्रांसडक्शन रिसेप्टर है जो वीईजीएफए16को बांधता है। इस जानकारी ने बेहतर समझ के लिए अनुमति दी कि कैसे विभिन्न वीईजीएफए आइसोफोर्म कूप प्रगति या गिरफ्तारी को प्राप्त करने के लिए सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करते हैं। एक साथ लिया, विभिन्न स्टेरॉयड या विकास कारकों के साथ विट्रो में डिम्बग्रंथि प्रांतस्था टुकड़ों की culturing एक मूल्यवान परख folliculogenesis को विनियमित तंत्र पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए हो सकता है. इसी तरह, विभिन्न पोषण संबंधी शासनों पर विकसित किए गए जानवरों में डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट्स को बदल दिया जा सकता है, जो महिला प्रजनन परिपक्वता को प्रभावित करने वाले फोलिकुलोजेनेसिस को बढ़ावा दे सकता है या बाधित कर सकता है। इस प्रकार, वर्तमान पांडुलिपि में हमारा लक्ष्य गोजातीय प्रांतस्था संस्कृति तकनीक की रिपोर्ट करना है और यह निर्धारित करना है कि क्या हेफ़र्स से गोजातीय प्रांतस्था की इन विट्रो संस्कृति के बाद डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में अंतर हैं या तो नियंत्रण या सीढ़ी-चरण आहार 13 महीने की उम्र में एकत्र किए गए हैं जैसा कि पहले16 वर्णितहै।
इसलिए, हमारा अगला कदम इन heifers है कि विभिन्न पोषण आहार के साथ विकसित किए गए थे में डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट निर्धारित करने के लिए किया गया था। हमने हाइफर्स से डिम्बग्रंथि प्रांतस्था का मूल्यांकन किया, जिसे या तो सीढ़ी-चरण या नियंत्रण आहार के साथ खिलाया गया था। नियंत्रण heifers 84 दिनों के लिए 97.9 ग्राम / किग्रा0.75 के रखरखाव आहार की पेशकश की गई थी। सीढ़ी-चरण आहार 8 महीने में शुरू किया गया था जिसमें 84 दिनों के लिए 67.4 ग्राम / किग्रा0.75 का प्रतिबंधित खिलाया गया आहार शामिल था। पहले 84 दिनों के बाद, जबकि कंट्रोल हेफ़र्स को 97.9 ग्राम / किग्रा0.75प्राप्त करना जारी रहा, सीढ़ी-चरण गोमांस हेफर्स को एक और 68 दिनों के लिए 118.9 ग्राम / किग्रा0.75 की पेशकश की गई, जिसके बाद उन्हें संस्कृति से पहले और बाद में कूपिक चरणों और आकृति विज्ञान में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए16 साल की उम्र में 13 महीने की उम्र में अंडाशय किया गया था। हम भी स्टेरॉयड, स्टेरॉयड चयापचयों, केमोकाइन्स, और साइटोकिन्स प्रांतस्था मीडिया में स्रावित में अंतर के लिए परख. स्टेरॉयड और अन्य चयापचयों को यह निर्धारित करने के लिए मापा गया था कि क्या ऊतक व्यवहार्यता और उत्पादकता पर विवो और / या इन विट्रो में किए गए उपचारों से कोई प्रत्यक्ष प्रभाव था। संस्कृति से पहले और बाद में डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन ने संस्कृति से पहले अंतःस्रावी परिवेश और फोलिकुलोजेनेसिस का एक स्नैपशॉट प्रदान किया और संस्कृति के दौरान संस्कृति या उपचार कूप प्रगति या गिरफ्तारी को कैसे प्रभावित करता है।
अंडाशय को16साल की उम्र में नियंत्रण और सीढ़ी-चरण heifers से अपने IACUC प्रक्रियाओं के अनुसार यूएस मीट एनिमल रिसर्च सेंटर (USMARC) में किए जाने के बाद अंडाशय एकत्र किए गए थे, रक्त और अन्य संदूषकों को हटाने के लिए 0.1% एंटीबायोटिक के साथ बाँझ फॉस्फेट बफर लवणीय (पीबीएस) धोने के साथ साफ किया गया था, अतिरिक्त ऊतक को छंटनी की गई थी, और नेब्रास्का-लिंकन विश्वविद्यालय (यूएनएल) प्रजनन फिजियोलॉजी प्रयोगशाला यूएनएल में 37 डिग्री सेल्सियस23 पर ले जाया गया था। . UNL में, डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को छोटे वर्ग टुकड़ों में काटा गया था (~ 0.5-1 मिमी3; चित्र 1) और 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत(चित्रा 2)। हिस्टोलॉजी को संस्कृति से पहले और बाद में कॉर्टेक्स संस्कृति स्लाइड पर आयोजित किया गया थाताकिरोम चरणों को निर्धारित किया जा सके16,24 (चित्रा 3 और चित्रा 4),और बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन जो फाइब्रोसिस (पिक्रो-सिरस रेड, पीएसआर) का संकेत दे सकते हैं; चित्रा 5)। इसने कूप चरणों पर विवो पोषण संबंधी शासनों के प्रभाव के निर्धारण की अनुमति दी और कूप चरणों और कूप प्रगति पर डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के 7 दिनों की तुलना की अनुमति दी। संस्कृति के दौरान, माध्यम को दैनिक रूप से एकत्र और बदल दिया गया था (लगभग 70% मीडिया प्रत्येक दिन एकत्र किया गया था; 250 μL / अच्छी तरह से) ताकि औसत सांद्रता प्राप्त करने के लिए दिनों में दैनिक हार्मोन / साइटोकिन्स / केमोकाइन्स का मूल्यांकन या पूल किया जा सके। एंड्रोस्टेनेडिओन (ए 4) और एस्ट्रोजन (ई 2) जैसे स्टेरॉयड को 3 दिनों में पूल किया जा सकता है और रेडियोइम्यूनोसे (आरआईए) के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है; चित्रा 6) और पशु प्रति 4 दिनों से अधिक pooled और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-एमएस)24, 25 (तालिका 1)के माध्यम से परख के माध्यम से. डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम 26(तालिका2) में साइटोकाइन और केमोकाइन सांद्रता का आकलन करने के लिए साइटोकाइन सरणियों का उपयोग किया गया था। वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) परख प्लेटों विशिष्ट संकेत ट्रांसडक्शन मार्गों के लिए जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए आयोजित किया गया था के रूप में पहले से प्रदर्शित16. स्टेरॉयड, साइटोकाइन, कूप चरण और हिस्टोलॉजिकल मार्करों के सभी डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट और सुराग का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं कि माइक्रोएन्वायरमेंट की क्षमता के रूप में “सामान्य” या “असामान्य” फोलिकुलोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति का लाभ, जैसा कि इस पांडुलिपि में वर्णित है, यह है कि रोम रोम के आसपास आसन्न स्ट्रोमा के साथ एक सामान्यीकृत वातावरण में विकसित होते हैं। दैहिक कोशिकाएं और ओसाइ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एएससी, एएससी के लिए स्वास्थ्य प्रतिस्पर्धी अनुदान के लिए नेब्रास्का खाद्य विश्वविद्यालय के लिए राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान 2013-67015-20965 द्वारा समर्थित किया गया था। संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग हैच अनुदान NEB26-202 / W3112 परिग्रहण # एएससी के लिए 1011127, हैच-एनईबी एएनएचएल परिग्रहण # एएससी के लिए 1002234। क्वांटिटेटिव लाइफ साइंसेज इनिशिएटिव समर पोस्टडॉक्टोरल स्कॉलर सपोर्ट – सीएमएस के लिए गर्मियों के वित्त पोषण के लिए कोविड -19 पुरस्कार।
लेखक डॉ रॉबर्ट कुशमैन, अमेरिकी मांस पशु अनुसंधान केंद्र, क्ले सेंटर, एनई को अपनी प्रशंसा का विस्तार करना चाहते हैं ताकि उन्हें पिछले प्रकाशन में अंडाशय प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया जा सके, जो तब इस तकनीक को मान्य करने में अवधारणा के प्रमाण के रूप में वर्तमान पेपर में उपयोग किए गए थे।
Materials
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
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