Detta manuskript beskriver ett protokoll för neutronradiografi och datortomografi av biologiska prover med hjälp av en högflödesisotopreaktor (HFIR) CG-1D-strålrör för att mäta ett metallimplantat i ett råttlårben, en muslunga och ett örtartat växtrot/jordsystem.
Neutroner har historiskt använts för ett brett spektrum av biologiska tillämpningar med tekniker som neutronspridning med liten vinkel, neutronspinneko, diffraktion och oelastisk spridning. Till skillnad från neutronspridningstekniker som får information i ömsesidigt utrymme, mäter dämpningsbaserad neutronavbildning en signal i verkligt utrymme som löses i storleksordningen tiotals mikrometer. Principen för neutronavbildning följer Beer-Lambert-lagen och baseras på mätningen av bulkneutrondämpningen genom ett prov. Större dämpning uppvisas av vissa ljuselement (framför allt väte), som är huvudkomponenter i biologiska prover. Kontrastmedel såsom deuterium, gadolinium eller litiumföreningar kan användas för att förbättra kontrasten på ett liknande sätt som det görs vid medicinsk bildbehandling, inklusive tekniker som optisk avbildning, magnetisk resonanstomografi, röntgen och positronemissionstomografi. För biologiska system har neutronradiografi och datortomografi alltmer använts för att undersöka komplexiteten hos det underjordiska växtrotnätverket, dess interaktion med jordar och dynamiken i vattenflödet in situ. Dessutom har ansträngningar för att förstå kontrastdetaljer i djurprover, såsom mjuka vävnader och ben, undersökts. Detta manuskript fokuserar på framstegen inom neutronbioimaging såsom provberedning, instrumentering, datainsamlingsstrategi och dataanalys med hjälp av High Flux Isotope Reactor CG-1D neutronavbildningsstrålrör. De ovan nämnda förmågorna kommer att illustreras med hjälp av ett urval av exempel inom växtfysiologi (örtartad växt/rot/jordsystem) och biomedicinska tillämpningar (råttlårben och muslunga).
Principen för neutronradiografi (nR) är baserad på dämpning av neutroner genom den materia som de passerar. Till skillnad från röntgenstrålar som sprids av en atoms elektronmoln kan neutroner absorberas eller spridas av dess kärna. Neutroner är känsliga för lätta element, såsom väte (H), och kan följaktligen användas för röntgenbilder av biologiska tillämpningar såsom djur 1,2,3,4,5,6,7 eller mänskliga vävnader 8,9 och underjordiska jord-/rotsystem 10,11,12,13,14 ,15. Neutronavbildning är en kompletterande teknik till röntgenavbildning, som kan detektera tunga element16,17,18. Dämpningsbaserad nR styrs av de linjära dämpningskoefficienterna för materialen i provet och av provets tjocklek, som beskrivs av Beer-Lambert-lagen, som säger att den överförda strålen är direkt proportionell mot mängden material och väglängden genom materialet. Således kan transmittansen, T, beräknas som:
(1)
där I 0 och I är respektive infallande och överförda strålintensiteter; μ och x är den linjära dämpningskoefficienten respektive tjockleken på ett homogent prov. Den μ dämpningskoefficienten erhålls genom
(2)
där σ är provets neutrondämpningstvärsnitt (både spridning och absorption), ρ är dess densitet, NA är Avogadros tal och M är dess molära massa.
Kontrast vid radiografi av biologiska prover med användning av lågenergineutroner (dvs energier under 0,5 eV) beror främst på en förändring i densiteten hos H (för en fast provtjocklek). Detta beror på sannolikheten för interaktion mellan en neutron och H-kärnan, vilket är större än med andra kärnor närvarande i biologiska prover, och det faktum att H-atomens densitet är avgörande eftersom den är den vanligaste atomen i biologiska prover.
Sedan dess tidiga stadier har nR och neutrondatortomografi (nCT) använts i stor utsträckning för material och tekniska applikationer 19,20,21,22,23. De första demonstrationsexperimenten med neutronkänslighet för H i biologiska prover började i mitten av 1950-talet24 med mätningar av växtprover. Arbetet fortsatte under 1960-talet med till exempel röntgen av en mänsklig bröstkorg25 eller råttor26, där användningen av kontrastmedel, såsom gadoliniumoxid (Gd2O3), undersöktes. Dessutom antogs det att kontrast i mänsklig tumörvävnad jämfört med normal vävnad berodde på en lokal ökning av H-innehållet. Under dessa inledande försök drogs slutsatsen att ökat neutronflöde och rumslig upplösning skulle förbättra kvaliteten på nR och sannolikt öka dess popularitet som en kompletterande teknik för industriella eller biomedicinska tillämpningar. De senaste studierna omfattar nR- och nCT-mätningar utförda på cancervävnadsprover1 och sektioner av djurorgan 2,3,27 för biomedicinska och rättsmedicinska tillämpningar.
Beläget vid Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, är High Flux Isotope Reactor (HFIR) en kraftfull neutronkälla som producerar neutroner genom fissionsreaktion. Dessa neutroner har energier i storleksordningen 2 MeV och “kyls” i reaktorpoolen genom kinetiska reaktioner med tungt vatten för att nå energier i storleksordningen 100-300 eV. Optimeringen av ett neutronexperiment, oavsett spridning eller avbildning, börjar med förståelsen av neutronkällan och strålrörets egenskaper, såsom dess strålintensitet, energifördelning och effekten av bakgrunden (snabba neutroner, fördröjda neutroner, gammastrålar). I HFIR cold guide hall där bildstrålröret är beläget, neutroner “kyls” ytterligare genom kinetiska interaktioner med en flytande H-moderator. De transporteras sedan i ett krökt styrsystem bort från källans siktlinje, vilket eliminerar snabba neutroner och gammaföroreningar. Som illustreras i figur 1 är CG-1D-strålröret28,29 placerat på en kall styrning, vilket innebär att neutronenergiområdet varierar från några meV till några tiotals eV (i detta fall varierar motsvarande användbara neutronvåglängd från 0,8 till 10 Å) med ett flöde i området 107 n / (cm2∙s) vid provpositionen. Ett motoriserat bländar-/diffusorsystem definierar bildinstrumentets hålgeometri. Neutroner färdas en sträcka på 6,59 m i ett helium (He) fyllt flygrör med aluminium (Al) fönster i varje ände. Flygrör används för att transportera neutroner samtidigt som luftspridningen begränsas så att förlusten i strålintensitet är minimal. För de mätningar som beskrivs i detta manuskript är diffusorn tillverkad av ett 1 mm tjockt 50 nm aluminiumoxid (Al2O3) nanopulver inneslutet i en Al-behållare. Diffusorn minskar strålartefakterna som kommer från neutronstyrningen (som förstoras av pinhole-geometrin hos ett bildstrålrör), annars är skarpa horisontella och vertikala intensitetsfluktuationer synliga i röntgenbilden och normalisering av data blir utmanande. För experimenten som illustreras här omvandlas neutroner till ljus med hjälp av en 25 μm tjock litium-6 fluorid / zinksulfidfosfor (6LiF / ZnS: Ag).
Kollimationsoptimering beror på prov-till-detektorns position, den nödvändiga rumsliga upplösningen och förvärvstiden. När provet sitter några cm från scintillatorn ger höga kollimationer (L / D över 800, där L är avståndet från pinhålets öppning av diameter, D och detektorn) bättre rumslig upplösning på bekostnad av neutronflöde. Låg kollimation (L/D under 800) är att föredra för dynamiska in situ-studier när tidsupplösningen väger tyngre än den rumsliga upplösningen. För mätningarna som beskrivs i detta manuskript var L/D och rumslig upplösning cirka 355 respektive 75 μm. Tidsupplösningen varierade beroende på signal-brusförhållandet (SNR). Provet placerades så nära scintillatorn som möjligt för att minska geometrisk distorsion såsom oskärpa. Översättnings- och rotationssteg finns tillgängliga för att ställa provet nära detektorerna och utföra datortomografi (CT). CG-1D erbjuder tre typer av detektorer: en laddningskopplad enhet (CCD) med 2048 pixlar x 2048 pixlar med en pixelhöjd på 13,5 μm, en vetenskaplig komplementär metalloxidhalvledardetektor (sCMOS) med 2560 pixlar x 2160 pixlar med en pixelhöjd på 6,5 μm och en mikrokanalplatta (MCP) detektor30,31 med 512 pixlar x 512 pixlar med en pixelstorlek på 55 μm. Spridda neutroner absorberas med ~ 5 mm tjockt borgummi för att skydda detektorchipet från att se neutroner. Denna absorption genererar gammastrålar som kan stoppas av bly (Pb) placerat mellan borgummit och detektorn. Varje detektor är optimerad för olika synfält (FOV) samt rumsliga och tidsupplösningar. För mätning av råttlårben och muslungor användes CCD-detektorn för sin stora synfältskapacitet (~ 7 cm x 7 cm) och rimliga rumsliga upplösning på cirka 75 μm. Växtrot/jordsystemets nCT utfördes med sCMOS, eftersom målet var att förvärva nCT så snabbt som möjligt på bekostnad av FOV (som var begränsad till ~ 5 cm x 4,2 cm); Således led rumslig upplösning uppenbarligen. I dessa detektorer omvandlas neutroner antingen till ljus eller en alfapartikel för detektionsändamål. Att rotera provet runt sin vertikala axel och förvärva röntgenbilder vid på varandra följande rotationsvinklar möjliggör förvärv av nCT. Den 3-dimensionella volymetriska renderade modellen av provet som undersöks erhålls genom att använda den interna iMARS3D python-baserade Jupyter filtered-back-projection (FBP) notebook, pyMBIR eller en kommersiell programvara, allt beskrivet nedan.
Slutligen samlas neutroner som inte har interagerat med provet eller detektorn i ett strålstoppläge cirka 1 m nedströms från detektorsystemet för att minimera bakgrundsbrus. CG-1D-strålstoppet är 0,75 m brett, 0,5 m högt och 35 mm tjockt och tillverkat av B4C i epoxi. Strålstoppet är förstärkt med 10 mm 95% anrikat litiumkarbonat (6 Li2CO3) i en brandbeständig epoxi där neutronstrålen träffar, med ett hålrum fodrat med 6Li, bly (Pb) och stål utformat för att innehålla den höga hastigheten av sekundära gammastrålar. Strålstoppet är direkt fäst vid strålrörets stålskärmningsvägg. Ett fotografi av CG-1D-strålröret ges i figur 2.
Tre rekonstruktionsprogram användes för att rekonstruera de tre experimentella data i 3D. Rekonstruktionen av muslungprovet utfördes med hjälp av Octopus32, en kommersiell rekonstruktionsprogramvara som använder FBP. Octopus-programvaran sitter på en serverdator och kan användas för att rekonstruera data som samlats in vid strålröret. En rekonstruktionsprogramvara, kallad iMARS3D, finns tillgänglig på CG-1D. Den är baserad på öppen källkod TomoPY33 med extra funktioner som automatiserad lutningskorrigering, efterbehandlingsfilter etc. iMARS3D inkluderar förbehandling av data (subtraktion av bakgrund och brus), beskärning, medianfiltrering (för att korrigera för gammastrejker och döda pixlar), automatisk korrigering av strålintensitetsfluktuationer och korrigering av provlutning. När sinogram har skapats är ytterligare databehandling som borttagning av ringartefakter och utjämning ett alternativ. De olika stegen i rekonstruktionen sparas på analysservern (och flyttas senare i den delade mappen för förslaget), medan de sista 2D-segmenten omedelbart lagras i den delade mappen för förslaget. Lårbenet på råtta rekonstruerades med iMARS3D. Växtrot/jordprovet förbehandlades genom medianfiltrering av data med TomoPY följt av lutningsaxelkorrigering med Pythons SciPy-bibliotek. Rekonstruktionen utfördes med hjälp av ett internt utvecklat pythonpaket kallat – pyMBIR (byggt med kärnor från ASTRA-verktygslådan34) som implementerar en serie tomografiska algoritmer från baslinjen FBP till avancerade modellbaserade iterativa rekonstruktionstekniker35 som kan få högkvalitativa rekonstruktioner från extremt glesa och bullriga neutrondatamängder. Alla renderade volymer baserade på de rekonstruktionsverktyg som nämns ovan representeras i dämpningskontrast. All visualisering utfördes med hjälp av det kommersiella programvarupaketet för visualisering, segmentering och dataanalys AMIRA36.
Detta manuskript syftar till att demonstrera proceduren för att använda neutronavbildning (nR och nCT) vid HFIR CG-1D-strålröret. Denna studie illustrerar också den nuvarande state-of-the-art nR- och nCT-kapaciteten för biologiska prover, särskilt en muslunga, ett råttben och växtrot- / jordsystem. Muslungan valdes för att illustrera komplementariteten hos neutroner för att mäta lungvävnaden, medan röntgenstrålar oftast är känsliga för ben. Benprovet, ett råttlårben, hade ett titan (Ti) implantat, vilket illustrerar kontrasten mellan benet och metallen och möjligheten att se ben/metallgränssnittet (vilket är svårt att mäta med röntgenstrålar eftersom metaller starkt dämpar dem4). Slutligen illustrerar växt-rotvattensystemet den tredimensionella (3D) förmågan hos nCT att mäta rot-/jordsystem in situ. Det visar dessutom fördelarna / nackdelarna med att använda nR för biologiska prover. Uppenbarligen kan denna metod säkert användas för att mäta vattendynamiken i ett växtrotsystem men kan inte betraktas som en levande djur- eller mänsklig bildteknik på grund av riskerna i samband med strålningsexponering, vilket begränsar studierna till antingen (döda) möss eller patologiliknande mätningar där till exempel ett vävnadsprov resekteras från en patient (djur eller människa) och bereds genom fixering innan det mäts i en neutronstråle.
Neutronradiografi och CT av biologiska prover är lovande avbildningstekniker som kompletterar röntgenavbildning eller magnetisk resonansbildning. De kritiska stegen för att utföra ett neutronavbildningsexperiment av ett biologiskt prov är relaterade till dess beredning och dess inneslutning vid strålröret. Optimering av ett experiment drivs av den vetenskapliga frågan som ska besvaras. Om vetenskapsfrågan kräver hög rumslig upplösning för att observera ett fenomen, krävs långa förvärvstider, och nackdelen med nCT (med synfält i cm-storlek) är att det tar timmar att utföra en skanning. Detta beror främst på skillnaden i det totala neutronflödet som finns tillgängligt vid en reaktor jämfört med en synkrotronkälla, där röntgen-CT-skanningar kan ta sekunder till minuter för några mm2 synfält. Även om metoden kan tillämpas på ex vivo-vävnadsprover extraherade från djur, kan den inte utvidgas in vivo till levande djur eller människor på grund av strålningsexponeringsrisken (t.ex. gammastrålar som produceras av neutroner och neutroninteraktioner med atomerna i provet). Det är dock väl lämpat för avbildning av växtrot-/jordinteraktioner (figur 7), såsom vattenupptagningsdynamik.
Fördelen med att använda snabb nCT för växtdynamik är känsligheten för H i vatten och frånvaron av strålningsskador på växten, till skillnad från röntgen-CT. Dessutom kan unik kontrast observeras från användningen av neutroner i ben / metallprover som ett råttlårben där metallen är relativt transparent jämfört med de omgivande vävnaderna (figur 5), vilket potentiellt undviker metallartefakter inducerade av röntgen CT39. Djurvävnader, såsom muslunga (figur 6), visar imponerande detektion av mjukvävnadsstruktur eftersom neutroner är känsliga för H, men rumslig upplösning är något den begränsande faktorn i dessa mätningar. Kontrast ges av H-atomerna närvarande i biologiska prover19,39.
Med framstegen med nya tekniker som neutrongitterinterferometri och förbättringen av rumslig upplösning (några mikron har nyligen rapporterats42,43) kan neutronavbildning erbjuda ännu nya kontrastmekanismer för biologiska vävnader med förbättrad rumslig upplösning. Utforskningen av neutroner med högre energi (för att möjliggöra mätningar av tjocka prover) lovar också möjligheten att mäta större delar av en djurvävnad som en intakt mus, vilket ger ännu nya möjligheter för biomedicinsk forskning.
The authors have nothing to disclose.
En del av denna forskning utnyttjade resurser vid High Flux Isotope Reactor, som drivs av ORNL, och sponsras av US Department of Energy, Office of Science, User Facilities, enligt kontrakt DE-AC05-00OR22725 med UT-Battelle, LLC. En del av denna forskning stöddes av ORNL genom Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship-programmet. Denna forskning sponsrades också av DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. Råtta lårbensprover erhölls från experiment utförda i samarbete med Dr. Rick Sumner vid Rush University Medical Center med finansiering erhållen från NIH (R01AR066562) och från Orthopedic Research and Education Foundation-Smith and Nephew award. Teamet vill tacka HFIR-supportteamen som möjliggör användningen av neutronspridningsstrålrör.
Aluminum containers | custom | Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | Mouse lung sample containment |
Deionized water or deuterium oxide | Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample | ||
Ethanol | Fisher | 04-355-223 | Mouse lung sample |
Gauze sponges | CardinalHealth | Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample | |
Growth chamber | Conviron | A1000 | Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample |
Laboratory balance | Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample | ||
Pure silica sand | US Silica Co. | Flint#13 | Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample |
Sprague-Dawley Rats | Harlan | Order Code: 002-US | Rat femur sample |
Titanium Rod | Goodfellow | TI007905 | Rat femur sample |