Dette manuskriptet beskriver en protokoll for nøytronradiografi og computertomografi av biologiske prøver ved hjelp av en High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D-strålelinje for å måle et metallimplantat i et rotte lårben, en muselunge og et urteaktig planterot / jordsystem.
Nøytroner har historisk blitt brukt til et bredt spekter av biologiske applikasjoner ved hjelp av teknikker som småvinklet nøytronspredning, nøytronspinnekko, diffraksjon og uelastisk spredning. I motsetning til nøytronspredningsteknikker som får informasjon i gjensidig rom, måler dempingsbasert nøytronavbildning et signal i det virkelige rom som er løst i størrelsesorden titalls mikrometer. Prinsippet om nøytronavbildning følger Beer-Lambert-loven og er basert på måling av bulknøytrondempingen gjennom en prøve. Større demping er utstilt av noen lette elementer (spesielt hydrogen), som er hovedkomponenter i biologiske prøver. Kontrastmidler som deuterium-, gadolinium- eller litiumforbindelser kan brukes til å forbedre kontrasten på lignende måte som det gjøres i medisinsk bildebehandling, inkludert teknikker som optisk bildebehandling, magnetisk resonansbilder, røntgen og positronutslippstomografi. For biologiske systemer har nøytronradiografi og computertomografi i økende grad blitt brukt til å undersøke kompleksiteten til det underjordiske planterotnettverket, dets interaksjon med jord og dynamikken til vannfluks in situ. Videre har innsats for å forstå kontrastdetaljer i dyreprøver, som bløtvev og bein, blitt utforsket. Dette manuskriptet fokuserer på fremskritt innen nøytronbioimaging som prøvepreparering, instrumentering, datainnsamlingsstrategi og dataanalyse ved bruk av High Flux Isotope Reactor CG-1D nøytronavbildningsstrålelinje. De nevnte evnene vil bli illustrert ved hjelp av et utvalg eksempler innen plantefysiologi (urteaktig plante-/rot-/jordsystem) og biomedisinske anvendelser (rotte-, lårben og muselunge).
Prinsippet om nøytronradiografi (nR) er basert på demping av nøytroner gjennom saken de krysser. I motsetning til røntgenstråler som er spredt av elektronskyen til et atom, kan nøytroner absorberes eller spres av kjernen. Nøytroner er følsomme for lette grunnstoffer, som hydrogen (H), og kan følgelig brukes til å røntgenfotografere biologiske anvendelser som dyr 1,2,3,4,5,6,7 eller humant vev 8,9 og underjordiske jord/rotsystemer 10,11,12,13,14 ,15. Nøytronavbildning er en komplementær teknikk til røntgenavbildning, som er i stand til å oppdage tunge elementer16,17,18. Dempningsbasert nR styres av de lineære dempingskoeffisientene til materialene i prøven og av tykkelsen på prøven, som beskrevet i Beer-Lambert-loven, som sier at den overførte strålen er direkte proporsjonal med mengden materiale og banelengden gjennom materialet. Dermed kan transmittansen, T, beregnes som:
(1)
hvor jeg 0 og jeg er henholdsvis hendelsen og overført stråleintensitet; μ og x er henholdsvis den lineære dempingskoeffisienten og tykkelsen på en homogen prøve. Dempningskoeffisienten μ er gitt ved:
(2)
hvor σ er prøvens nøytrondempingstverrsnitt (både spredning og absorpsjon), ρ er dens tetthet, NA er Avogadros tall, og M er dens molare masse.
Kontrast i radiografi av biologiske prøver ved bruk av nøytroner med lav energi (dvs. energier under 0, 5 eV) skyldes hovedsakelig en endring i tettheten av H (for en fast prøvetykkelse). Dette skyldes sannsynligheten for interaksjon av et nøytron med H-kjernen, som er større enn med andre kjerner som er tilstede i biologiske prøver, og det faktum at tettheten av H-atomet er avgjørende da det er det rikeste atom i biologiske prøver.
Siden de tidlige stadiene har nR og nøytroncomputertomografi (nCT) blitt mye brukt til materialer og tekniske applikasjoner 19,20,21,22,23. De første demonstrasjonsforsøkene av nøytronfølsomhet for H i biologiske prøver begynte på midten av 1950-tallet24 med målinger av planteprøver. Arbeidet fortsatte gjennom 1960-tallet med for eksempel radiografi av en human bryst25 eller rotter26, der bruk av kontrastmidler, som gadoliniumoksid (Gd2O3), ble utforsket. Videre ble det antatt at kontrast i humant tumorvev versus normalt vev skyldtes en lokal økning i H-innhold. Under disse innledende forsøkene ble det konkludert med at økt nøytronfluks og romlig oppløsning ville forbedre kvaliteten på nR og sannsynligvis øke populariteten som en komplementær teknikk for industrielle eller biomedisinske applikasjoner. De nyeste studiene omfatter nR- og nCT-målinger utført på kreftvevsprøver1 og snitt av dyreorganer 2,3,27 for biomedisinske og rettsmedisinske anvendelser.
Ligger på Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, er High Flux Isotope Reactor (HFIR) en kraftig nøytronkilde som produserer nøytroner ved fisjonsreaksjon. Disse nøytronene har energier i størrelsesorden 2 MeV og blir “avkjølt” i reaktorbassenget ved kinetiske reaksjoner med tungt vann for å nå energier i størrelsesorden 100-300 eV. Optimaliseringen av et nøytroneksperiment, enten spredning eller avbildning, starter med forståelsen av nøytronkilden og strålelinjeegenskaper som stråleintensitet, energifordeling og effekten av bakgrunn (raske nøytroner, forsinkede nøytroner, gammastråler). I HFIR-kuldestyringshallen hvor avbildningsstrålelinjen er plassert, blir nøytronene ytterligere “avkjølt” ved kinetiske interaksjoner med en flytende H-moderator. De transporteres deretter i et buet føringssystem vekk fra synslinjen til kilden, og eliminerer dermed raske nøytroner og gammaforurensning. Som illustrert i figur 1, er CG-1D nøytron-imaging strålelinje28,29 plassert på en kald guide, noe som innebærer at nøytronenergiområdet varierer fra noen få meV til noen få titalls eV (i dette tilfellet varierer den tilsvarende brukbare nøytronbølgelengden fra 0,8 til 10 Å) med en fluks i området 107 n / (cm2 ∙s) i prøveposisjonen. Et motorisert blenderåpnings-/diffusorsystem definerer knappenålsgeometrien til bildebehandlingsinstrumentet. Nøytroner reiser en avstand på 6,59 m i et helium (He) fylt flyrør med aluminium (Al) vinduer i hver ende. Flyrør brukes til å transportere nøytroner mens de begrenser luftspredningen slik at tapet i stråleintensitet er minimum. For målingene beskrevet i dette manuskriptet er diffusoren laget av et 1 mm tykt 50 nm aluminiumoksid (Al2O3) nanopulver innkapslet i en Al-beholder. Diffusoren reduserer stråleartefaktene som kommer fra nøytronføringen (som forstørres av pinhole-geometrien til en bildestrålelinje), ellers er skarpe horisontale og vertikale intensitetsfluktuasjoner synlige i røntgenbildet og normalisering av dataene blir utfordrende. For eksperimentene som er illustrert her, omdannes nøytroner til lys ved hjelp av et 25 μm tykt litium-6 fluorid / sinksulfidfosfor (6LiF / ZnS: Ag).
Kollimeringsoptimalisering avhenger av prøve-til-detektor-posisjonen, den nødvendige romlige oppløsningen og innsamlingstiden. Når prøven sitter noen få cm fra scintillatoren, gir høye kollimasjoner (L / D over 800, hvor L er avstanden fra pinhole-blenderåpningen til diameter, D og detektoren) bedre romlig oppløsning på bekostning av nøytronfluks. Lav kollimasjon (L/D under 800) er å foretrekke for in situ dynamiske studier når tidsoppløsning råder over romlig oppløsning. For målingene beskrevet i dette manuskriptet var L/D og romlig oppløsning henholdsvis ca. 355 og 75 μm. Tidsoppløsningen varierte basert på signal-støy-forholdet (SNR). Prøven ble plassert så nær scintillatoren som mulig for å redusere geometrisk forvrengning som uskarphet. Oversettelses- og rotasjonstrinn er tilgjengelige for å sette prøven nær detektorene og utføre computertomografi (CT). CG-1D tilbyr tre typer detektorer: en ladningskoblet enhet (CCD) med 2048 piksler x 2048 piksler med en pikselhøyde på 13.5 μm, en vitenskapelig komplementær metalloksid halvleder (sCMOS) detektor med 2560 piksler x 2160 piksler med en pikselhøyde på 6.5μm, og en mikrokanalplate (MCP) detektor30,31 med 512 piksler x 512 piksler med en pikselstørrelse på 55μm. Spredte nøytroner absorberes med ~ 5 mm tykk borgummi for å beskytte detektorbrikken mot å se nøytroner. Denne absorpsjonen genererer gammastråler som kan stoppes av bly (Pb) plassert mellom borgummi og detektoren. Hver detektor er optimalisert for et annet synsfelt (FOV) samt romlige og tidsoppløsninger. For rotte lårben og musens lungemålinger ble CCD-detektoren benyttet for sin store FOV-evne (~ 7 cm x 7 cm) og rimelig romlig oppløsning på ca. 75μm. Planterot-/jordsystemets nCT ble utført med sCMOS, da målet var å skaffe nCT så raskt som mulig på bekostning av FOV (som var begrenset til ~ 5 cm x 4,2 cm); Dermed led romlig oppløsning tydeligvis. I disse detektorene blir nøytroner enten omdannet til lys eller en alfa-partikkel for deteksjonsformål. Ved å rotere prøven rundt den vertikale aksen og anskaffe røntgenbilder ved påfølgende rotasjonsvinkler kan man oppnå nCT. Den 3-dimensjonale volumetriske gjengitte modellen av prøven som undersøkes, oppnås ved å bruke den interne iMARS3D pythonbaserte Jupyter filtered-back-projection (FBP) notatboken, pyMBIR eller en kommersiell programvare, alt beskrevet nedenfor.
Til slutt samles nøytroner som ikke har interagert med prøven eller detektoren i en strålestoppposisjon ca. 1 m nedstrøms fra detektorsystemet for å minimere bakgrunnsstøy. CG-1D bjelkestopp er 0,75 m bred, 0,5 m høy og 35 mm tykk og laget av B4C i epoksy. Strålestopperen er forsterket med 10 mm 95% anriket litiumkarbonat (6 Li2CO3) i en brannsikker epoksy hvor nøytronstrålen treffer, med et hulrom foret med 6Li, bly (Pb) og stål designet for å inneholde den høye frekvensen av sekundære gammastråler. Bjelkestopperen er direkte festet til bjelkens stålvegg. Et fotografi av CG-1D-strålelinjen er gitt i figur 2.
Tre rekonstruksjonsprogrammer ble brukt til å rekonstruere de tre eksperimentelle dataene i henholdsvis 3D. Rekonstruksjonen av muselungeprøven ble utført ved hjelp av Octopus32, en kommersiell rekonstruksjonsprogramvare som bruker FBP. Octopus-programvare sitter på en server-PC og kan brukes til å rekonstruere data samlet inn ved strålelinjen. En rekonstruksjonsprogramvare, kalt iMARS3D, er tilgjengelig på CG-1D. Den er basert på åpen kildekode TomoPY33 med tilleggsfunksjoner som automatisert tiltkorreksjon, etterbehandlingsfiltre, etc. iMARS3D inkluderer forhåndsbehandling av dataene (subtraksjon av bakgrunn og støy), beskjæring, medianfiltrering (for å korrigere for gammaangrep og døde piksler), automatisk stråleintensitetsfluktuasjonskorreksjon og prøvehellingskorreksjon. Når sinograms er opprettet, er ytterligere databehandling som fjerning av ringartefakter og utjevning et alternativ. De forskjellige trinnene i rekonstruksjonen lagres på analyseserveren (og flyttes senere i den delte mappen for forslaget), mens de endelige 2D-skivene umiddelbart lagres i den delte mappen for forslaget. Rottelårbenet ble rekonstruert ved hjelp av iMARS3D. Planterot-/jordprøven ble forhåndsbehandlet ved medianfiltrering av dataene ved hjelp av TomoPY etterfulgt av vippeaksekorreksjon ved hjelp av Pythons SciPy-bibliotek. Rekonstruksjonen ble utført ved hjelp av en pythonpakke utviklet internt kalt – pyMBIR (bygget ved hjelp av kjerner fra ASTRA verktøykasse34) som implementerer en pakke med tomografiske algoritmer fra baseline FBP til avanserte modellbaserte iterative rekonstruksjonsteknikker35 som kan oppnå rekonstruksjoner av høy kvalitet fra ekstremt sparsomme og støyende nøytrondatasett. Alle gjengitte volumer basert på de nevnte rekonstruksjonsverktøyene er representert i dempingskontrast. All visualisering ble utført ved hjelp av den kommersielle visualiserings-, segmenterings- og dataanalyseprogramvarepakken AMIRA36.
Dette manuskriptet tar sikte på å demonstrere prosedyren for bruk av nøytronavbildning (nR og nCT) ved HFIR CG-1D-strålelinjen. Denne studien illustrerer også dagens toppmoderne nR- og nCT-evner for biologiske prøver, spesielt en muselunge, et rottebein og planterot / jordsystemer. Muselungen ble valgt for å illustrere komplementariteten til nøytroner for å måle lungevevvet, mens røntgenstråler er mest følsomme for bein. Benprøven, et rotteben, hadde et titanimplantat (Ti), noe som illustrerer kontrasten mellom bein og metall, og muligheten til å se bein/metall-grensesnittet (som er vanskelig å måle med røntgenstråler da metaller sterkt demper dem4). Til slutt illustrerer planterotvannsystemet den tredimensjonale (3D) evnen til nCT til å måle rot-/jordsystemer in situ. Den viser i tillegg fordelene/ulempene ved å bruke nR til biologiske prøver. Åpenbart kan denne metoden trygt brukes til å måle vanndynamikk i et planterotsystem, men kan ikke betraktes som et levende dyr eller menneskelig bildebehandlingsteknikk på grunn av risikoen forbundet med strålingseksponering, og dermed begrense studier til enten (døde) mus eller patologilignende målinger hvor for eksempel en vevsprøve resekteres fra en pasient (dyr eller menneske) og fremstilles ved fiksering før den måles i en nøytronstråle.
Nøytronradiografi og CT av biologiske prøver er lovende avbildningsteknikker som er komplementære til røntgenavbildning eller magnetisk resonansavbildning. De kritiske trinnene i å utføre et nøytronavbildningseksperiment av en biologisk prøve er relatert til dens forberedelse og inneslutning ved strålelinjen. Optimalisering av et eksperiment drives av det vitenskapelige spørsmålet som skal besvares. Hvis vitenskapsspørsmålet krever høy romlig oppløsning for å observere et fenomen, kreves det lange anskaffelsestider, og ulempen med nCT (med cm størrelse synsfelt) er at det tar timer å utføre en skanning. Dette skyldes for det meste forskjellen i total nøytronfluks tilgjengelig ved en reaktor sammenlignet med en synkrotronkilde, hvor røntgen-CT-skanninger kan ta sekunder til minutter for noen få mm2 synsfelt. Selv om metoden kan brukes på ex vivo vevsprøver ekstrahert fra dyr, kan den ikke utvides in vivo til levende dyr eller mennesker på grunn av strålingseksponeringsrisikoen (for eksempel gammastråler produsert av nøytroner og nøytroninteraksjoner med atomene i prøven). Det er imidlertid godt egnet for avbildning av planterot / jordinteraksjoner (figur 7) som vannopptaksdynamikk.
Fordelen med å bruke rask nCT for plantedynamikk er følsomheten for H i vann og fraværet av strålingsskader på planten, i motsetning til røntgen CT. Videre kan unik kontrast observeres ved bruk av nøytroner i bein-/metallprøver som et rottefemur hvor metallet er relativt gjennomsiktig sammenlignet med det omkringliggende vevet (figur 5), noe som potensielt unngår metallartefakter indusert av røntgen CT39. Animalsk vev, som muselunge (figur 6), viser imponerende påvisning av bløtvevstruktur fordi nøytroner er følsomme for H, men romlig oppløsning er noe begrensende faktor i disse målingene. Kontrast er gitt av H-atomer tilstede i biologiske prøver19,39.
Med fremskritt av nye teknikker som nøytrongitterinterferometri, og forbedringen i romlig oppløsning (noen få mikron har nylig blitt rapportert42,43) kan nøytronavbildning tilby enda nye kontrastmekanismer for biologisk vev med forbedret romlig oppløsning. Utforskningen av nøytroner med høyere energi (for å tillate målinger av tykke prøver) lover også muligheten til å måle større deler av et animalsk vev som en intakt mus, og gir dermed enda nye muligheter for biomedisinsk forskning.
The authors have nothing to disclose.
En del av denne forskningen benyttet ressurser på High Flux Isotope Reactor, som drives av ORNL, og sponset av US Department of Energy, Office of Science, User Facilities, under kontrakt DE-AC05-00OR22725 med UT-Battelle, LLC. En del av denne forskningen ble støttet av ORNL gjennom Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship-programmet. Denne forskningen ble også sponset av DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. Rotte lårprøver ble hentet fra eksperimenter utført i samarbeid med Dr. Rick Sumner ved Rush University Medical Center med finansiering hentet fra NIH (R01AR066562) og fra Orthopedic Research and Education Foundation-Smith and Nephew award. Teamet ønsker å takke HFIR-støtteteamene som muliggjør bruk av nøytronspredningsstrålelinjene.
Aluminum containers | custom | Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | Mouse lung sample containment |
Deionized water or deuterium oxide | Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample | ||
Ethanol | Fisher | 04-355-223 | Mouse lung sample |
Gauze sponges | CardinalHealth | Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample | |
Growth chamber | Conviron | A1000 | Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample |
Laboratory balance | Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample | ||
Pure silica sand | US Silica Co. | Flint#13 | Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample |
Sprague-Dawley Rats | Harlan | Order Code: 002-US | Rat femur sample |
Titanium Rod | Goodfellow | TI007905 | Rat femur sample |