Her præsenterer vi en protokol for adenovirusproduktion ved hjælp af pAdEasy-systemet. Teknologien omfatter rekombination af pAdTrack og pAdEasy-1 plasmider, adenovirusemballage og forstærkning, rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysat og kulturmedie, virustitrering og funktionel test af adenovirus.
Adenoviral transduktion har den fordel, at en stærk og forbigående induktion af ekspressionen af interessegenet i en bred vifte af celletyper og organer. Men rekombinant adenoviral teknologi er besværlig, tidskrævende og dyrt. Her præsenterer vi en forbedret protokol ved hjælp af pAdEasy-systemet til at opnå rensede adenovirale partikler, der kan fremkalde et stærkt grønt fluorescerende protein (GFP) udtryk i transducerede celler. Fordelene ved denne forbedrede metode er hurtigere forberedelse og lavere produktionsomkostninger sammenlignet med den oprindelige metode udviklet af Bert Vogelstein. De vigtigste trin i adenoviral teknologi er: (1) rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier; 2) emballering af adenoviralpartiklerne 3) forstærkning af adenovirus i AD293-celler 4) rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysat og dyrkningsmedium og 5) virustitrering og funktionel testning af adenovirus. Forbedringerne af den oprindelige metode består af (i) rekombinationen i BJ5183-holdige pAdEasy-1 ved kemisk omdannelse af bakterier; ii) udvælgelse af rekombinante kloner ved hjælp af “negative” og “positive” PCR — overførsel af AD293-celler ved hjælp af K2-transfekturesystemet til adenoviralemballage iv) udfældning med ammoniumsulfat af de viruspartikler, der frigives af AD293-celler i cellekulturmedium og v) rensning af virusset ved hjælp af et trins cæsiumchlorid diskontinuerlig gradient ultracentrifugering. Et stærkt udtryk for interessegenet (i dette tilfælde GFP) blev opnået i forskellige typer transducerede celler (såsom hepatocytter, endotelceller) fra forskellige kilder (human, kvæg, murin). Adenoviral-medieret genoverførsel er et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.
Adenovirus er ikke-vidtrækkende vira, der indeholder en nucleocapsid og et dobbeltstrenget lineært DNA-genom1,2,3. Adenovirus kan inficere en bred vifte af celletyper, og infektion er ikke afhængig af aktiv værtscelledeling. Efter infektion introducerer adenovirus sit genomiske DNA i værtscellens kerne, hvor det forbliver epikromosomalt og transskriberes sammen med værtens gener. Således opnås en minimal potentiel risiko for insertional mutagenesis eller oncogenes regulering4,5,6. Det adenovirale genom replikeres ikke sammen med værtsgenomet, og dermed fortyndes adenovirale gener i en dividere cellepopulation. Blandt fordelene ved adenoviral transduktion er der: (i) høje niveauer af transgene udtryk; ii) reducerede risici i forbindelse med integreringen af det virale DNA i værtsgenomet på grund af episomalt udtryk — transduktion af en lang række celletyper, der deler sig og ikke deler sig. De fleste adenovirus , der anvendes i biomedicinsk forskning , er ikke-repliktive og mangler E1-region7,8,9. Til deres produktion kræves en cellelinje, der leverer E1-sekvensen (f.eks. Desuden blev en ikke-væsentlig region for den virale livscyklus (E3) slettet for at tillade indsættelse af en transgen i det virale genom; andre regioner (E2 og E4) blev yderligere slettet i nogle adenovirus, men i disse tilfælde blev der rapporteret om et nedsat udbytte af adenoviralproduktionen og et lavt udtryk for transgenet7.
Her præsenterer vi en forbedret protokol til konstruktion, emballering og rensning af adenovirus ved hjælp af AdEasy-systemet. Disse forbedringer gjorde det muligt at pakke adenovirus på en hurtigere og mere økonomisk måde sammenlignet med den oprindelige metode udviklet af Bert Vogelstein2,10, på grund af følgende fordele: (i) rekombinationen i BJ5183-holdige pAdEasy-1 ved kemisk transformation af bakterier; ii) pcr’s valg af rekombinantklon — overførsel af AD293-celler ved hjælp af K2-transfekturesystemet til adenoviralemballage iv) udfældning af adenovirale partikler fra dyrkningsmediet efter viral emballage og forstærkning — adenoviralrensning ved hjælp af et trins cæsiumchlorid (CSCl) gradient ultracentrifugering.
Protokollen for produktion af adenovirus ved hjælp af AdEasy-systemet (figur 1) omfatter følgende trin:
(1) Rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 i BJ5183 bakterier
2) Emballering af adenoviralpartiklerne
3) Forstærkning af adenovirus
(4) Rensning af adenovirale partikler fra celle lysat og dyrkning medium
(5) Adenovirus titrering.
Figur 1: Adenovirusproduktionsteknologien. De vigtigste trin i adenoviral teknologi er: (1) Rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier. De udvalgte rekombinerede plasmider forstærkes i DH5α bakterier og renses derefter; (2) Emballering af adenovirale partikler i AD293-celler, der producerer adeno-E1-proteiner; (3) Forstærkning af adenovirus i AD293-celler; (4) Rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysatet og dyrkningsmediet ved ultracentrifugering på en CSCl-tæthedsgradient; (5) Titreringen af adenovirus og den funktionelle test. Klik her for at se en større version af dette tal.
I denne protokol eksemplificerede vi teknologien til produktion af adenovirus, som kan fremkalde udtrykket af GFP i værtscellerne. GFP er allerede indsat i rygraden i pAdTrack-CMV shuttle vektor (Addgene #16405), under en anden CMV promotor og bruges som en reporter gen (Figur 1). Derfor udpegede vi her pAdTrack-CMV-vektoren som pAdTrack-GFP, og vi vurderede GFP’s udtryk til demonstrative formål. Udover GFP-udtryk kan systemet bruges til at overekspressere et gen af interesse, som kan klones på pAdTrack-CMV’s mange kloningssteder. Et gen eller en minigen klonet i pAdTrack-CMV er normalt mere effektiv til ekspressionsinduktion sammenlignet med cDNA11. Dataene viste et stærkt GFP-udtryk i transducerede celler (såsom hepatocytter, endotelceller) fra forskellige kilder (human, kvæg, murin). Adenoviral-medieret genoverførsel er et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.
Rekombinant adenovirus er et alsidigt værktøj til genlevering og udtryk12,13,14. For at fremkalde stærkt proteinudtryk ved adenoviral transduktion indsættes kodningssekvensen af det pågældende gen i adenovirusgen. AdEasy adenoviral system, udviklet i laboratoriet af Bert Vogelstein, består af en rygrad plasmid (pAdEasy-1), der indeholder de fleste af de vilde-type adenovirus serotype 5 genom, og en shuttle vektor (pAdTrack), designet til gen kloning2,10. Sletningen af adenoviral gener E1 (ansvarlig for samling af infektiøse viruspartikler) og E3 (kodning af proteiner, der er involveret i at undgå værtsimmunitet) skabte et rum i det adenovirale genom, hvor et gen af interesse på 6,5-7,5 kb kan indsættes2,3. Denne størrelse er tilstrækkelig til mange gener, især for dem med kortere introner15,16,17. Der er også forskere, der rapporterer om produktion af adenovirus , der bærer cDNA af en transgene18,19,20. Vi opnåede dog et lavere udbytte af transgenekspression for cDNA-bærende adenovirus end for deres modparter, der bærer et gen eller et minigen (data vises ikke).
Forbedring og tilpasning af de tidligere metoder2,10,14,18,21, teknologien til adenoviral produktion kræver kortere tid, lavere omkostninger og mindre indsats. Den fulde længde adenoviral DNA opnås ved rekombination mellem shuttle vektor og pAdEasy-1 plasmid i homolog rekombination udsat E. coli stamme, BJ5183. Protokollen indebærer den kemiske transformation af AdEasier-1 celler (BJ5183 bakterier, der indeholder pAdEasy-1). Denne teknik kræver ikke en elektroporator, der muligvis ikke er tilgængelig i nogle laboratorier, er meget enkel, øger rekombinationsudbyttet og reducerer den tid, der er nødvendig for at opnå kompetente celler og udføre transformationen. Forvalget af rekombinante kloner udført af PCR forkorter tiden yderligere og letter hele proceduren. En lignende procedure blev brugt af Zhao og kolleger22, men i protokollen optimerede vi primernes sekvenser.
Til GFP-adenovirusemballage og forstærkning blev der anvendt en HEK293 afledt cellelinje, nemlig AD293-celler, som er mere klæbende til kulturpladen. Andre cellelinjer, der almindeligvis anvendes til adenoviral produktion, er følgende: 911, 293FT, pTG6559 (A549 derivat), PER. C6 (HER derivat), GH329 (HeLa afledte), N52. E6, og HeLa-E123,24,25,26. I vores hænder blev der ikke opnået nogen forbedring i adenoviralproduktionen, da der blev brugt 911 celler (data vises ikke). Transfekten af AD293-celler med rekombinant plasmid ved hjælp af K2-reagens øgede i høj grad effektiviteten af det virale emballagetrin. Efter adenovirus produktion, op til ~ 70% af adenovirus er stadig inde i cellerne og frigives af tre frysning og optøning cykler. At øge antallet af cyklusser er ikke egnet, fordi det ødelægger adenovirus.
Gennem hele den rutinemæssige adenoviral produktionsproces frigives mange virale partikler i cellekulturmediet. Kassering af dette cellekulturmedium under høsten af de inficerede AD293-celler ville resultere i et vigtigt viralt tab. Vi optimerede protokollen beskrevet af Schagen og kolleger for at rense adenoviralpartiklerne fra cellekulturmediet ved nedbør med ammoniumsulfat27. Denne metode har en højere effektivitet i adenovirusgenvinding fra cellekulturmediet sammenlignet med metoden ved hjælp af polyethylenglycol28. Den udfældede adenovirus skal renses straks ved ultracentrifugering eller opbevares i køleskabet i et par dage, men kun efter dialyse, for at fjerne saltoversvømmelsen. At holde bundfaldet længere end et par timer uden dialyse er skadeligt for virussen.
Rensning af adenoviral partikler ved ultracentrifugering udført i et trin reducerer manipulationen af adenoviralbestanden og letter proceduren sammenlignet med protokollerne ved hjælp af successive ultracentrifugeringstrin14,29. Dialyse af den rensede adenovirus er nødvendig for at fjerne cæsiumchlorid, der yderligere kan påvirke transduktionen. I protokollen brugte vi Tris buffer indeholdende MgCl2, men ikke saccharose til dialyse, da det kræver en enorm, uberettiget mængde saccharose, der ellers er nødvendig som konserveringsmiddel til frysning. Således tilføjede vi saccharose senere direkte i de adenovirale lagre, der var forberedt til frysning. For at undgå hyppig frysning og optøning af den rensede adenovirus anbefales det at aliquot adenoviralbestandene og opbevare dem ved -80 °C. Adenoviral titer blev evalueret af flowcytometry i betragtning af GFP reporter genet og procentdelen af transducerede celler for en bestemt viral fortynding. Denne metode er hurtigere sammenlignet med den klassiske “plaque assay” og er mere tillidsfuld sammenlignet med evalueringen af capsidproteiner (ved forskellige metoder som ELISA eller flow cytometry), som ikke afslører infektionskapaciteten hos adenoviralpartiklerne. Elisa-baseret kvantificering, Q-PCR eller plakanalyse ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits er imidlertid alternative metoder, især nyttige til titrering af adenovirus, som ikke indeholder et fluorescerende sporstof.
I betragtning af at pAdTrack adenovirus er afledt af humane adenoviruses serotype 5, som er anerkendt af Coxsackievirus og Adenovirus Receptors (CAR), demonstrerede vi GFP-adenovirussens evne til at transduce celler af menneskelig oprindelse (endothelialceller), men også celler af anden oprindelse: kvæg (endothelialceller) og murin (mesenchymale stromale celler og heocpatytter). Dataene viste, at GFP-adenovirus kan fremkalde et højt udtryk for en transgene.
Afslutningsvis optimerede vi denne besværlige teknologi for at reducere tiden, omkostningerne og den indsats, der er nødvendig for at opnå de adenovirale partikler. Den forberedte adenovirus er i stand til at inficere forskellige celletyper og fremkalde ekspressionen af det af interessegenet. Denne protokol kan anvendes i en række forsøg, da den adenoviral-medierede genoverførsel udgør et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.
FORKORTELSER: AdV-GFP, adenoviral partikler; BAEC, akreortatiske endotelceller; CsCl, cæsiumchlorid; GFP, grønt fluorescerende protein; MSC, mesenchymale stromale celler; TU, transducerende enheder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et projekt, der medfinansieres af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling gennem det operationelle program for konkurrenceevne 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; akronym DIABETER), en bevilling fra det rumænske ministerium for forskning og innovation PCCDI- UEFISCDI, projektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 inden for PNCD III og af det rumænske akademi. Forfatterne takker Kyriakos Kypreos (University of Patras, Grækenland) for hans generøse og relevante råd, Ovidiu Croitoru (University of Fine Arts, Bukarest, Rumænien) for at filme, filmredigering og grafisk design, og Mihaela Bratu for teknisk bistand.
AD293 cells | Agilent Technologies | 240085 | |
AdEasier-1 cells | Addgene | 16399 | |
Agarose I (for electrophoresis) | Thermo Scientific | 17850 | |
Ammonium sulfate | Sigma | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma | A0166 | |
BamH I | Thermo Scientific | FD0054 | |
Cell culture plates 100 mm | Eppendorf | 30702115 | |
Cesium chloride | Sigma | L4036 | |
DH5alpha bacteria | Thermo Scientific | 18265017 | |
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) | Gibco | 3240-027 | |
EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol (99.8%) | Roth | 5054.2 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524 | |
Flasks T25, T75, T175 | Eppendorf | 30712129 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Hepa 1-6 murine hepatocytes | ATCC | CRL-1830 | |
Hind III | Thermo Scientific | FD0504 | |
Kanamycin Sulfate | Thermo Scientific | 15160054 | |
K2 Transfection System | Biontex | T060-5.0 | |
LB medium | Formedium | LBx0102 | |
LB-agar | Formedium | LBx0202 | |
Mix & Go E. coli Transformation kit | Zymo Research | T3001 | |
Midori Green Advanced DNA stain | Nippon Genetics Europe | MG-04 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Opti-MEM | Thermo Scientific | 31985070 | |
Pac I | Thermo Scientific | FD2204 | |
pAdEasy-1 | Addgene | 16400 | |
pAdTrack-CMV | Addgene | 16405 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) | Invitrogen | 15593-031 | |
Polymerase GoTaq | Promega | M3005 | |
Pme I (Mss I) | Thermo Scientific | FD1344 | |
Potassium acetate | VWR Chemicals | 43065P | |
Pst I | Thermo Scientific | FD0614 | |
Qiagen Midi Prep kit | Qiagen | 12125 | |
Cell Scraper | TPP | 99003 | |
SDS | Thermo Scientific | 28365 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66330 | |
Sodium pyruvate | SIGMA | P5280-100G | |
Syringe with 23G neeedle | B Braun | 464BR | |
Tris HCl | Sigma | 1185-53-1 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Tubes 50ml | TPP | 91050 | |
Ultra-Clear Tubes (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Centrifuge (refrigerated) | Sigma Sartorius | 3-19KS | |
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | |
Culture Hood | Thermo Scientific | Class II | |
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) | Thermo Scientific | ||
Dry Block Heating Thermostat | Biosan | TDB-120 | |
Thermocycle | SensoQuest | 012-103 | |
Water Bath | Memmert | WNB 14 |