Här presenterar vi ett protokoll för adenovirusproduktion med hjälp av pAdEasy-systemet. Tekniken inkluderar rekombination av pAdTrack och pAdEasy-1 plasmider, adenovirusförpackningar och förstärkning, rening av adenoviralpartiklarna från celllyat och odlingsmedium, virustitration och funktionell testning av adenoviruset.
Adenoviral transduktion har fördelen av en stark och övergående induktion av uttrycket av genen av intresse i en bred variation av celltyper och organ. Rekombinant adenoviral teknik är dock mödosam, tidskrävande och dyr. Här presenterar vi ett förbättrat protokoll med pAdEasy-systemet för att erhålla renade adenoviralpartiklar som kan inducera ett starkt grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i transduced celler. Fördelarna med denna förbättrade metod är snabbare beredning och minskad produktionskostnad jämfört med den ursprungliga metoden som utvecklats av Bert Vogelstein. De viktigaste stegen i adenoviral-tekniken är: (1) rekombinationen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1-plasmiden i BJ5183-bakterier; 2. Förpackningen av adenoviralpartiklarna. 3. Förstärkning av adenoviruset i AD293-celler. 4. Rening av adenoviralpartiklar från celllyat och odlingsmedium. och (5) viral titrering och funktionstestning av adenoviruset. Förbättringarna av den ursprungliga metoden består av i) rekombinationen i BJ5183-innehållande pAdEasy-1 genom kemisk omvandling av bakterier; ii) Val av rekombinanta kloner med “negativ” och “positiv” PCR. iii) Transfektion av AD293-celler med hjälp av transfekteringssystemet K2 för adenoviralförpackningar. iv) Utfällning med ammoniumsulfat av de viruspartiklar som frigörs av AD293-celler i cellkulturmedium. och v) rening av viruset genom ettstegs cesiumkloridavsättningsgradient ultracentrifugering. Ett starkt uttryck för genen av intresse (i detta fall GFP) erhölls i olika typer av transduced celler (såsom hepatocyter, endotelceller) från olika källor (människa, nötkreatur, murin). Adenoviral-medierad genöverföring representerar ett av de viktigaste verktygen för att utveckla moderna genterapier.
Adenovirus är icke-utstärpade virus som innehåller en nukleocapsid och ett dubbelsträngat linjärt DNA-genom1,2,3. Adenovirus kan infektera ett brett spektrum av celltyper och infektion är inte beroende av aktiv värdcellsdelning. Efter infektion introducerar adenoviruset sitt genomiska DNA i värdcellskärnan, där det förblir episkt och transkriberas tillsammans med värdens gener. Således uppnås en minimal potentiell risk för införande av mutagenes eller onkogenreglering4,5,6. Adenoviral genomet replikeras inte tillsammans med värdgenomet och därmed späds adenoviralgenerna ut i en delningscellpopulation. Bland fördelarna med adenoviral transduktion finns det: i) höga nivåer av transgene uttryck; ii) Minskade risker i samband med integreringen av virus-DNA i värdgenomet på grund av episomalt uttryck. iii) Transduktion av en mängd olika delnings- och icke-delande celltyper. De flesta adenovirus som används i biomedicinsk forskning är icke-replikiva, saknar E1-regionen7,8,9. För deras produktion krävs en cellinje som levererar E1-sekvensen (till exempel HEK293). Dessutom togs en icke-nödvändig region för viruslivscykeln (E3) bort för att möjliggöra införandet av en transgen i virusgenomet. Andra regioner (E2 och E4) ströks ytterligare i vissa adenovirus, men i dessa fall rapporterades en minskad avkastning av adenoviral produktion och lågt uttryck för transgen7.
Här presenterar vi ett förbättrat protokoll för konstruktion, förpackning och rening av adenovirus med hjälp av AdEasy-systemet. Dessa förbättringar gjorde det möjligt att packa adenoviruset på ett snabbare och mer ekonomiskt sätt jämfört med den ursprungliga metoden som utvecklats av Bert Vogelstein2,10, på grund av följande fördelar: i) rekombinationen i BJ5183-innehållande pAdEasy-1 genom kemisk omvandling av bakterier; ii) PCR:s val av rekombinanta kloner. iii) Transfektion av AD293-celler med hjälp av transfekteringssystemet K2 för adenoviralförpackningar. iv) Utfällning av adenoviralpartiklar från odlingsmedium efter viral förpackning och förstärkning. v) adenoviral rening med hjälp av ettstegs cesiumklorid (CsCl) gradient ultracentrifugation.
Protokollet för produktion av adenovirus med hjälp av AdEasy-systemet(figur 1)omfattar följande steg:
(1) Rekombination av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 i BJ5183 bakterier
(2) Förpackning av adenoviralpartiklarna
(3) Förstärkning av adenoviruset
(4) Rening av adenoviralpartiklar från celllyat och odlingsmedium
(5) Adenovirustitration.
Figur 1: Adenovirusproduktionstekniken. Huvudstegen i adenoviraltekniken är: (1) Rekombinationen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1-plasmiden i BJ5183-bakterier. De utvalda rekombinerade plasmiderna förstärks i DH5α-bakterier och renas sedan; (2) Förpackningen av adenoviralpartiklarna i AD293-celler som producerar adeno-E1-proteiner. (3) Förstärkning av adenoviruset i AD293-celler. (4) Rening av adenoviralpartiklarna från celllyat och odlingsmedium genom ultracentrifugation på en CsCl-densitetsgradient. (5) Titreringen av adenoviruset och den funktionella testningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
I detta protokoll exemplifierade vi tekniken för produktion av adenoviruset, vilket kan inducera uttrycket av GFP i värdcellerna. GFP är redan insatt i ryggraden på pAdTrack-CMV shuttle vector (Addgene #16405), under en andra CMV-promotor och används som reportergen (Figur 1). Av denna anledning utsåg vi här pAdTrack-CMV-vektorn som pAdTrack-GFP och vi bedömde GFP:s uttryck för demonstrativa ändamål. Förutom GFP-uttryck kan systemet användas för att överuttrycka en gen av intresse, som kan klonas på pAdTrack-CMV: s flera kloningsplatser. En gen eller en minigen klonad i pAdTrack-CMV är vanligtvis effektivare för uttrycksinduktion jämfört med cDNA11. Data visade ett starkt GFP-uttryck i transduced celler (såsom hepatocyter, endotelceller) från olika källor (människa, nötkreatur, murin). Adenoviral-medierad genöverföring representerar ett av de viktigaste verktygen för att utveckla moderna genterapier.
Rekombinanta adenovirus är ett mångsidigt verktyg för genleverans och uttryck12,13,14. För att inducera starka protein uttryck genom adenoviral transduktion, kodning sekvensen av genen av intresse infogas i arvsmassan av adenoviruset. AdEasy adenoviral-systemet, utvecklat i Bert Vogelsteins laboratorium, består av en ryggradsplasmid (pAdEasy-1) som innehåller det mesta av det vilda typ adenoviruset serotyp 5 genom och en skyttelvektor (pAdTrack), utformad för genkloning2,10. Borttagningen av adenoviralgenerna E1 (ansvarig för montering av infektiösa viruspartiklar) och E3 (kodningsproteiner som är involverade i att undvika värdimmunitet) skapade ett utrymme i adenoviralgenomet, där en gen av intresse på 6,5-7,5 kb kan infogas2,3. Denna storlek är tillräcklig för många gener, särskilt för dem med kortare introner15,16,17. Det finns också forskare som rapporterar produktionen av adenovirus som bär cDNA av en transgen18,19,20. Vi fick dock en lägre avkastning av transgene uttryck för cDNA-bärande adenovirus än för deras motsvarigheter som bär en gen eller en mini-gen (data visas inte).
Att förbättra och anpassa de tidigaremetoderna 2,10,14,18,21, tekniken för adenoviral produktion kräver en kortare tid, lägre kostnad och mindre ansträngning. Adenoviral DNA i full längd erhålls genom rekombination mellan skyttelvektorn och pAdEasy-1-plasmiden i den homologa rekombinationsbenägna E. coli-stammen BJ5183. Protokollet innebär kemisk omvandling av AdEasier-1-celler (BJ5183 bakterier som innehåller pAdEasy-1). Denna teknik kräver inte en elektroporator som kanske inte är tillgänglig i vissa laboratorier, är mycket enkel, ökar rekombinationsutbytet och minskar den tid som krävs för att få kompetenta celler och utföra omvandlingen. Förvalet av rekombinanta kloner som utförs av PCR förkortar ytterligare tiden och underlättar hela proceduren. Ett liknande förfarande användes av Zhao och medarbetare22, men i protokollet optimerade vi sekvenserna av primers.
För GFP-adenovirusförpackningen och förstärkningen användes en HEK293 derivatcelllinje, nämligen AD293-celler, som är mer vidhäftande till odlingsplattan. Andra cellinjer som vanligen används för adenoviral produktion är följande: 911, 293FT, pTG6559 (A549 derivat), PER. C6 (HER derivat), GH329 (HeLa derivat), N52. E6 och HeLa-E123,24,25,26. I våra händer erhölls ingen förbättring av adenoviral produktionen när 911 celler användes (data visas inte). Transfektionen av AD293-celler med rekombinant plasmid med K2-reagens ökade kraftigt effektiviteten i virusförpackningssteget. Efter adenovirusproduktion är upp till ~ 70% av adenoviruset fortfarande inuti cellerna och frigörs av tre frys- och upptiningscykler. Att öka antalet cykler är inte lämpligt eftersom det förstör adenoviruset.
Under hela den rutinmässiga adenoviral produktionsprocessen frigörs många viruspartiklar i cellkulturmediet. Att kassera detta cellkulturmedium under skörden av de infekterade AD293-cellerna skulle resultera i en viktig virusförlust. Vi optimerade protokollet som beskrivs av Schagen och medarbetare för att rena adenoviral partiklarna från cellkulturmediet genom nederbörd med ammoniumsulfat27. Denna metod har en högre effektivitet i adenovirus återhämtning från cellkulturmediet jämfört med metoden med polyetylenglykol28. Det fällda adenoviruset ska renas omedelbart genom ultracentrifugation eller förvaras i kylskåpet i ett par dagar men först efter dialys, för att avlägsna saltöverskottet. Att hålla fällningen längre än några timmar utan dialys är skadligt för viruset.
Rening av adenoviral partiklar genom ultracentrifugation utförs i ett steg minskar manipuleringen av adenoviral beståndet och underlättar förfarandet jämfört med protokollen med hjälp av successiva ultracentrifugation steg14,29. Dialys av det renade adenoviruset är nödvändigt för att avlägsna cesiumklorid som ytterligare kan påverka transduktion. I protokollet använde vi Tris buffert som innehåller MgCl2 men inte sackaros för dialys, eftersom det kräver en enorm, omotiverad mängd sackaros som annars behövs som konserveringsmedel för frysning. Således lade vi till sackaros senare, direkt i adenoviralla bestånden som är beredda för frysning. För att undvika frekvent frysning och upptining av det renade adenoviruset är det lämpligt att alikvotera adenoviralla lager och lagra dem vid -80 °C. Adenoviral titer utvärderades av flöde cytometri med tanke på GFP reporter genen och andelen transduced celler för en specifik viral utspädning. Denna metod är snabbare jämfört med den klassiska “plackanalysen” och är mer pålitlig jämfört med utvärderingen av kapsidproteinerna (med olika metoder som ELISA eller flödescytometri) som inte avslöjar infektionskapaciteten hos adenoviralpartiklarna. ELISA-baserad kvantifiering, Q-PCR eller plackanalys med kommersiellt tillgängliga kit är dock alternativa metoder, särskilt användbara för titrering av adenovirus som inte innehåller en fluorescerande spårämne.
Med tanke på att pAdTrack adenovirus härrör från humana adenovirus serotyp 5 som känns igen av Coxsackievirus och Adenovirus Receptorer (CAR), visade vi kapaciteten hos GFP-adenovirus att omvandla celler av mänskligt ursprung (endotelceller), men också celler av annat ursprung: nötkreatur (endotelceller) och murin (mesenchymala stromala celler och hepatocyter). Data visade att GFP-adenovirus kan inducera en hög grad av uttryck av en transgene.
Sammanfattningsvis optimerade vi denna mödosamma teknik för att minska tiden, kostnaderna och den ansträngning som krävs för att få adenoviralpartiklarna. Det adenovirus som framställs kan infektera olika celltyper och inducera uttrycket av intressegenen. Detta protokoll kan användas i en mängd olika experiment eftersom den adenoviral-medierade genöverföringen representerar ett av de viktigaste verktygen för att utveckla moderna genterapier.
FÖRKORTNINGAR: AdV-GFP, adenovirala partiklar; BAEC, bovina aorta endotelceller. CsCl, cesiumklorid; GFP, grönt fluorescerande protein; MSC, mesenchymala stromal celler; TU, givarenheter.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett projekt som medfinansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden genom det operativa programmet för konkurrenskraft 2014–2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; förkortning diabeter), ett bidrag från det rumänska ministeriet för forskning och innovation PCCDI- UEFISCDI, projektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 inom PNCD III och av den rumänska akademin. Författarna tackar Kyriakos Kypreos (University of Patras, Grekland) för hans generösa och relevanta råd, Ovidiu Croitoru (University of Fine Arts, Bukarest, Rumänien) för filmning, filmredigering och grafisk design, och Mihaela Bratu för teknisk hjälp.
AD293 cells | Agilent Technologies | 240085 | |
AdEasier-1 cells | Addgene | 16399 | |
Agarose I (for electrophoresis) | Thermo Scientific | 17850 | |
Ammonium sulfate | Sigma | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma | A0166 | |
BamH I | Thermo Scientific | FD0054 | |
Cell culture plates 100 mm | Eppendorf | 30702115 | |
Cesium chloride | Sigma | L4036 | |
DH5alpha bacteria | Thermo Scientific | 18265017 | |
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) | Gibco | 3240-027 | |
EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol (99.8%) | Roth | 5054.2 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524 | |
Flasks T25, T75, T175 | Eppendorf | 30712129 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Hepa 1-6 murine hepatocytes | ATCC | CRL-1830 | |
Hind III | Thermo Scientific | FD0504 | |
Kanamycin Sulfate | Thermo Scientific | 15160054 | |
K2 Transfection System | Biontex | T060-5.0 | |
LB medium | Formedium | LBx0102 | |
LB-agar | Formedium | LBx0202 | |
Mix & Go E. coli Transformation kit | Zymo Research | T3001 | |
Midori Green Advanced DNA stain | Nippon Genetics Europe | MG-04 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Opti-MEM | Thermo Scientific | 31985070 | |
Pac I | Thermo Scientific | FD2204 | |
pAdEasy-1 | Addgene | 16400 | |
pAdTrack-CMV | Addgene | 16405 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) | Invitrogen | 15593-031 | |
Polymerase GoTaq | Promega | M3005 | |
Pme I (Mss I) | Thermo Scientific | FD1344 | |
Potassium acetate | VWR Chemicals | 43065P | |
Pst I | Thermo Scientific | FD0614 | |
Qiagen Midi Prep kit | Qiagen | 12125 | |
Cell Scraper | TPP | 99003 | |
SDS | Thermo Scientific | 28365 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66330 | |
Sodium pyruvate | SIGMA | P5280-100G | |
Syringe with 23G neeedle | B Braun | 464BR | |
Tris HCl | Sigma | 1185-53-1 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Tubes 50ml | TPP | 91050 | |
Ultra-Clear Tubes (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Centrifuge (refrigerated) | Sigma Sartorius | 3-19KS | |
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | |
Culture Hood | Thermo Scientific | Class II | |
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) | Thermo Scientific | ||
Dry Block Heating Thermostat | Biosan | TDB-120 | |
Thermocycle | SensoQuest | 012-103 | |
Water Bath | Memmert | WNB 14 |