यहां प्रस्तुत गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (डीएनपी) जादू कोण कताई (MAS) परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) जांच में जमे हुए नमूनों के क्रायोजेनिक हस्तांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल है । प्रोटोकॉल में प्रयोग से पहले रोटर भंडारण के लिए निर्देश शामिल हैं और प्रयोग से पहले और बाद में व्यवहार्यता माप के लिए निर्देश।
गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (डीएनपी) नाटकीय रूप से जादू कोण कताई (MAS) परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी की संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है। तापमान में कमी के रूप में ये संवेदनशीलता लाभ में वृद्धि होती है और अधिकांश वाणिज्यिक डीएनपी-सुसज्जित एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के ऑपरेटिंग तापमान (~ 100 K) पर बहुत कम सांद्रता पर अणुओं के अध्ययन को सक्षम करने के लिए काफी बड़ी होती है। इससे उनके मूल वातावरण में अपने अंतर्जात स्तरों पर मैक्रोमॉलिक्यूल्स के लिए क्रायोप्रेरेवित कोशिकाओं पर इन-सेल संरचनात्मक जीव विज्ञान की संभावना होती है। हालांकि, सेलुलर क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए आवश्यक फ्रीजिंग दरें डीएनपी एमएएस एनएमआर के लिए विशिष्ट नमूना हैंडलिंग के दौरान पार हो जाती हैं और इसके परिणामस्वरूप सेलुलर अखंडता और व्यवहार्यता की हानि होती है। यह लेख एमएएस एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में स्तनधारी कोशिकाओं के जमे हुए नमूने की तैयारी और क्रायोजेनिक हस्तांतरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
जादू कोण कताई परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण की शुरूआत परिमाण के कई आदेशों से MAS एनएमआर की संवेदनशीलता को बढ़ा सकती है । इससे उनकी शारीरिक सांद्रता पर या उसके पास जैव अणुओं का पता लगाने में सक्षम हो गया है। DNP जटिल जैविक वातावरण1में अंतर्जात (~ 1 माइक्रोन) सांद्रता पर आइसोटोपिकल रूप से लेबल प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता प्रदान कर सकता है और प्रदान करता है। क्योंकि उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना अवेलेबल स्तनधारी कोशिकाओं में आइसोटोपिकल लेबल वाले अणुओं को पेश करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल हैं, यह उनके मूल वातावरण में अपने अंतर्जात स्तर पर आइसोटोपिक रूप से समृद्ध जैव अणुओं का अध्ययन करने की संभावना को खोलता है। इसके अलावा, क्योंकि डीएनपी संवर्द्धन कमतापमान2,3,4पर अधिक कुशल होते हैं, इसलिए डीएनपी एमएएस एनएमआर के लिए प्रायोगिक तापमान व्यवहार्य स्तनधारी कोशिकाओं के दीर्घकालिक भंडारण के लिए आवश्यक लोगों के साथ बड़े करीने से संरेखित होता है5। हालांकि, एक नमूना को डीएनपी एमएएस एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में स्थानांतरित करने की पारंपरिक विधि यह तापमान में उतार-चढ़ाव दरों के अधीन है जो स्तनधारी कोशिकाओं को टूटना है।
एमएएस एनएमआर प्रयोगों के लिए आवश्यक है कि नमूने को एनिसोट्रोपिक इंटरैक्शन के परिमाण के बराबर या उससे अधिक आवृत्तियों पर जादू कोण के बारे में घुमाया जाए, जो आमतौर पर कम से कम 4 किलोहर्ट्ज और अक्सर कम से कम6,7,8,9से अधिक होता है। इसलिए, नमूनों को रोटर में पैक किया जाता है जिसमें एक फिन्ड टिप होता है जिसका उपयोग गैस की धारा द्वारा रोटर के घूर्णन को चलाने के लिए किया जाता है और दूसरे छोर पर एक निशान होता है ताकि रोटेशन आवृत्ति की निगरानी टैकोमीटर द्वारा की जा सके। अधिकांश एमएएस एनएमआर उपकरणों के लिए नमूना हस्तांतरण शुष्क हवा या नाइट्रोजन गैस की धारा के साथ एनएमआर जांच के अंत में उपकरण के बाहरी से स्टेटर में रोटर इंजेक्शन द्वारा पूरा किया जाता है। रोटर के स्टेटर तक पहुंचने के बाद, जो जादू कोण पर रोटर रखता है, नमूना रोटेशन एक एयर टरबाइन तंत्र द्वारा चालित होता है। गैस समर्थन की अलग धाराएं, रोटर के तापमान को प्रेरित और नियंत्रित करें। एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में एक रोटर डालने और स्थिर MAS कताई को प्राप्त करने के लिए पतले मशीन ड्राइव सुझावों और तापमान और गैस की अलग धाराओं के दबाव के तंग नियंत्रण की आवश्यकता है । इन तकनीकी मांगों के बावजूद, प्रविष्टि और स्थिर MAS प्राप्त करने के लिए काफी हद तक कमरे के तापमान अनुप्रयोगों के लिए वाणिज्यिक MAS एनएमआर जांच के लिए स्वचालित हैं ।
हालांकि, कम तापमान अनुप्रयोगों के लिए स्थिति अधिक जटिल है। कम तापमान अनुप्रयोगों के लिए नमूने आम तौर पर कमरे के तापमान पर स्पेक्ट्रोमीटर में डाला जाता है और स्टेटर में जमे हुए। पहले मिनट में सैंपल का तापमान जल्दी कम हो जाता है (>−100 डिग्री सेल्सियस/मिनट) और सिस्टम के तापमान को बराबरी करने के लिए कई मिनट की जरूरत होती है । तापमान और दबाव के परस्पर क्रिया के कारण, वांछित MAS के सम्मिलन और आ अक्सर कम तापमान वाले अनुप्रयोगों के लिए मैन्युअल रूप से संभाला जाता है। मैनुअल हस्तक्षेप के लिए आवश्यकता के बावजूद, उपकरण के अंदर रोटर को ठंडा करना फायदेमंद है क्योंकि यह जांच में पानी और संघनन की शुरूआत को कम करता है, जो सफल कताई के लिए महत्वपूर्ण है। न केवल संघनन और बर्फ का निर्माण कर सकते है परिवेश नमी ब्लॉक गैस लाइनों, संघनन, या रोटर पर ठंढ से ही यंत्रवत् MAS को रोका जा सकता है । इस प्रकार, कम तापमान MAS एनएमआर के लिए नमूने आम तौर पर -100 डिग्री सेल्सियस/मिनट से अधिक दरों पर उपकरण के अंदर जमे हुए हैं।
स्तनधारी कोशिकाएं फ्रीज-गल चक्र के माध्यम से अपनी अखंडता को बनाए रख सकती हैं यदि ठंडा5,10,11,12, 1डिग्री सेल्सियस/मिनट के बराबर या धीमी दर पर धीमा है। वैकल्पिक रूप से कोशिकाएं भी अपनी अखंडता बनाए रखती हैं यदि ठंडा दर अल्ट्रा-फास्ट13,14,15है, जो 104 डिग्री सेल्सियस/मिनट से तेज दर पर है। इन दो चरम सीमाओं के मध्यवर्ती दरों टूटना और दोनों कोशिकाओं के अंदर और बाहर बर्फ क्रिस्टल गठन के कारण स्तनधारी कोशिकाओं को मारने, यहां तक कि क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों की उपस्थिति में16। इन दो चरम सीमाओं के बीच एक पूर्व-ठंडा जांच गिरावट के अंदर एक कमरे के तापमान रोटर के लिए नमूना ठंडा दर, इस प्रकार क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित अक्षुण्ण व्यवहार्य स्तनधारी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, नमूनों को उपकरण में स्थानांतरित करने से पहले जमे हुए होना चाहिए और तापमान में उतार-चढ़ाव के बिना उपकरण में स्थानांतरित किया जाना चाहिए जो रोटर पर ठंढ के नमूने या संचय को नुकसान पहुंचा सकता है जो रोटर को कताई से रोक सकता है। प्रोटोकॉल क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित अक्षुण्ण व्यवहार्य स्तनधारी कोशिका नमूनों के अध्ययन के लिए क्रायोजेनिक एमएएस एनएमआर प्रणाली में ठंढ मुक्त, पूर्व-कूल्ड रोटर प्रविष्टि के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यहां वर्णित क्रायोजेनिक नमूना हस्तांतरण व्यवहार्य अक्षुण्ण कोशिकाओं के एनएमआर लक्षण वर्णन के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, यह किसी भी प्रणाली पर लागू होता है जहां तापमान में उतार-चढ़ाव नमूना अखंडता से समझौता कर सकता है। इसमें किसी भी प्रकार की जटिल प्रणालियां शामिल हैं, जैसे फंसे हुए प्रतिक्रिया मध्यवर्ती17, 18,एंजायमोलॉजी19,20 या प्रोटीन फोल्डिंग21, 22के रासायनिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए फ्रीज शमन प्रतिक्रियाएं।
एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में जमे हुए नमूनों का क्रायोजेनिक हस्तांतरण एनएमआर डेटा अधिग्रहण के माध्यम से जमे हुए स्तनधारी कोशिकाओं की व्यवहार्यता को संरक्षित करने में सफल है। इस पद्धति की सफलता पूर्व और पोस्ट MAS एनएमआर व्यवहार्यता माप में प्रदर्शित की जाती है। यह दृष्टिकोण किसी भी प्रणाली के लिए सफल और सामान्य रूप से है जहां तापमान में उतार-चढ़ाव नमूना अखंडता से समझौता कर सकता है। वर्तमान में प्रस्तुत प्रोटोकॉल HEK 293 सेल लाइन के साथ किया जाता है। क्योंकि कई स्तनधारी कोशिका रेखाओं के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन की स्थिति बहुत समान है, इसकी संभावना है कि यहां रिपोर्ट की गई स्थितियां अन्य सेलुलर प्रणालियों में अनुवाद योग्य हैं; हालांकि, उन्हें समान परिणाम प्राप्त करने के लिए क्रायोप्रोटेक्टेंट, नमूना मात्रा और फ्रीजिंग दरों के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
एनएमआर प्रयोग के बाद रोटर को तेजी से अनपैक करके इस पद्धति में सुधार किया जा सकता है। यह कदम वर्तमान में उप इष्टतम है और इसका निष्पादन कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है। इससे पहले कि कोशिकाओं को मीडिया में फिर से निलंबित किया जा सकता है, ड्राइव टिप और सिलिकॉन प्लग रोटर से हटा दिया जाना चाहिए । नमूना असमान रूप से गल जाता है जब रोटर ड्राइव टिप और सिलिकॉन प्लग को हटाने के दौरान आयोजित किया जाता है तो कम रोटर हैंडलिंग समय उच्च वायाबिलिटी में परिणाम होता है। रोटर धारकों या अन्य उपकरणों के विकास के लिए एक समान विगलन और ड्राइव टिप और सिलिकॉन प्लग के त्वरित हटाने की सुविधा के लिए व्यवहार्यता के बाद एनएमआर आकलन और अधिक सटीक बनाने में सहायता करेगा ।
इस लेख में वर्णित क्रायोजेनिक नमूना लोडिंग के दृष्टिकोण एनएमआर जांच तक सीमित है जो एनएमआर चुंबक के बोर में जांच के साथ नमूना प्रविष्टि और इंजेक्शन का समर्थन करता है। जबकि बाहरी नमूना प्रविष्टि और रिजेक्शन वाणिज्यिक डीएनपी सिस्टम के लिए मानक है, कस्टम जांच हमेशा यह विकल्प नहीं है। इसके अलावा, क्रायोजेनिक नमूना लोडिंग के लिए इस दृष्टिकोण को विभिन्न आकार के रोटरों के साथ संगत होने के लिए निर्मित एनएमआर जांच के लिए कुछ संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल को 3.2 मिमी रोटर के लिए अनुकूलित किया गया है और यदि नमूना पकड़ने वाले का बाहरी व्यास माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (जैसे, चरण 3.4.2) के आंतरिक व्यास से अधिक है तो संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।
एमएएस एनएमआर को डीएनपी के आवेदन के साथ, अब अंतर्जात शारीरिक सांद्रता24, 25, 26में प्रोटीन और अन्य जैव अणुओं का पतालगानासंभव है। यह उनके मूल वातावरण के भीतर जैव अणुओं का अध्ययन करने की संभावना को खोलता है। पूरे प्रयोग में सेलुलर अखंडता और व्यवहार्यता का रखरखाव स्पेक्ट्रोस्कोपी के प्रयोगात्मक परिणामों को जैविक घटनाओं से जोड़ने में महत्वपूर्ण होने की संभावना है। शुद्ध प्रोटीन या सेलुलर lysates युक्त नमूनों की अनियंत्रित ठंड आमतौर पर नमूना गुणवत्ता 7,27से समझौता नहीं करती है, हालांकि कुछ संकेत हैं कि शुद्ध प्रणालियों में भी ठंड की दर एक महत्वपूर्ण परिवर्तनीय हो सकती है28. हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं के नमूनों को नियंत्रित दर पर जमे हुए होने की जरूरत है अगर सेलुलर बरकरारपन और व्यवहार्यता के संरक्षण व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है । यहां हम स्तनधारी कोशिकाओं के जमे हुए नमूनों को पूर्व-कूल्ड डीएनपी एमएएस एनएमआर उपकरण में ठंडा करने और स्थानांतरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो संभावित रूप से हानिकारक तापमान में उतार-चढ़ाव से बचता है और व्यवहार्य कोशिकाओं पर माप का समर्थन करता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को टेक्सास के कैंसर रिसर्च प्रिवेंशन एंड रिसर्च इंस्टीट्यूट [RR150076], नेशनल साइंस फाउंडेशन [1751174] के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान [एनएस-111236], वेल्च फाउंडेशन [1-1923-20170325]; Lupe Murchison फाउंडेशन, टेड नैश लांग लाइफ फाउंडेशन और रिश्तेदारी फाउंडेशन (Searle विद्वानों कार्यक्रम) केकेएफ के लिए
0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
Black and Silver marker | Sharpie | ||
Cap removing tool | Bruker ? | ||
Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
Ceramic cap | Bruker | ||
CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron | Bruker | ||
Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
Kimwipes | Kimwipes | ||
Packaging tool | Bruker ? | ||
Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
Silicon plug | Bruker | ||
Standard Vessel forceps | |||
Tryp-L | Gibco | 12605010 |