Her præsenterer vi en protokol til forberedelse og montering af Caenorhabditis elegans embryoner, registrering af udvikling under et 4D-mikroskop og sporing af celleafstamning.
4D-mikroskopi er et uvurderligt værktøj til at optrævle den embryonale udviklingsproces hos forskellige dyr. I løbet af de sidste årtier har Caenorhabditis elegans vist sig som en af de bedste modeller til at studere udvikling. Fra et optisk synspunkt gør dens størrelse og gennemsigtige krop denne nematode til en ideel prøve til DIC (Differential Interference Contrast eller Nomarski) mikroskopi. Denne artikel illustrerer en protokol til dyrkning af C. elegans nematoder, forberedelse og montering af deres embryoner, udførelse af 4D-mikroskopi og sporing af cellestamning. Metoden er baseret på multifokale time-lapse-registreringer af Nomarski-billeder og analyse med specifik software. Denne teknik afslører embryonal udviklingsdynamik på cellulært niveau. Enhver embryonal defekt i mutanter, såsom problemer i spindelorientering, cellemigration, apoptose eller celleskæbnespecifikation, kan effektivt detekteres og scores. Næsten hver eneste celle i embryoet kan følges op til det øjeblik, embryoet begynder at bevæge sig. Sporing af den komplette celleafstamning af et C. elegans embryo ved 4D DIC-mikroskopi er besværligt, men brugen af specifik software letter i høj grad denne opgave. Derudover er denne teknik let at implementere i laboratoriet. 4D-mikroskopi er et alsidigt værktøj og åbner mulighed for at udføre en uovertruffen analyse af embryonal udvikling.
4D-mikroskopi er et multifokalt time-lapse-registreringssystem, der gør det muligt for forskere at registrere og kvantificere celledynamikken i en biologisk prøve både rumligt og over tid. Cellekulturer, gær eller levende væv kan underkastes 4D-analyse, men denne teknik er især velegnet til at analysere udviklingen af levende embryoner. Opløsningen af denne analyse når niveauet for hver enkelt celle i embryoet. Hver celledeling kan detekteres, og cellebevægelser kan spores over tid. Celleskæbner vurderes i henhold til den position og form, som cellerne erhverver. Brugen af Nomarski-optik forbedrer kontrasten mellem ufarvede gennemsigtige prøver ved hjælp af ortogonalt polariserede lysstråler, der forstyrrer brændplanet. De resulterende billeder vises tredimensionelle, belyst på den ene side.
Andre metoder baseret på anvendelse af konfokalmikroskopi og GFP transgene dyr til automatisk påvisning af kerner og generering af celleafstamninger er blevet udviklet 1,2. Fordelen ved disse systemer er indlysende: Softwaren tilsidesætter i høj grad behovet for manuelt at markere hver kerne over en periode (selv om der kræves en vis manuel overvågning i de sene faser). Imidlertid forbliver cellulære processer, der involverer ændringer i celleform eller membrandynamik, såsom dem, der forekommer under celledifferentiering, migration, apoptose eller ligopslugning, skjult som en sort baggrund i de fluorescerende mærkede kernebilleder.
I modsætning hertil viser 4D Nomarski-mikroskopi (også kaldet DIC-mikroskopi, Differential Interference Contrast-mikroskopi) både kerner og celleformændringer, der opstår under udviklingen af vildtype eller mutante dyr. Dette muliggør sporing af celleafstamning ved hjælp af standardmikroskoper, der kun anvender transmitteret lys. Der er ikke noget generelt behov for at anvende transgene dyr undtagen for at vise specifikke ekspressionsmønstre, i hvilket tilfælde fluorescerende scanninger kan interkaleres. Derfor kan dette være den optimale tilgang for mange laboratorier, der arbejder med dynamiske celleprocesser såsom embryogenese eller apoptose, der kan fremhæves under DIC-mikroskopi 3,4,5,6,7.
Flere fleksible og brugervenlige programmer er tilgængelige til optagelse af mikroskopiske billeder og rekonstruktion af celleafstamninger, 3D-modeller, cellemigrationsstier osv. I den optagede prøve. I et standardeksperiment erhverves billeder i en række brændplaner i konstant afstand, hvis antal afhænger af prøvetykkelsen. Tidsmæssig opløsning af analysen kan optimeres ved at øge scanningsfrekvensen. Der er stort set ingen grænse for optagelsens varighed bortset fra computerens lagerkapacitet. For eksempel til en C. elegans embryoudviklingsanalyse erhverver vi rutinemæssigt billeder på 30 fokusplaner (1 mikron-trin hvert 30. sekund i 12 timer.
Disse systemer er blevet anvendt til analyse af flere dyreembryoner såsom Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andre nematodeembryoner12,13, bjørnedyr14,15 og endda tidlige museembryoner16. Det eneste krav er at have et gennemsigtigt embryo, der er i stand til at udvikle sig på diaspræparatet under mikroskopet.
Sammenfattende er DIC-baseret 4D-mikroskopi især nyttig til 1) analyse af embryonal udvikling af små, gennemsigtige dyr: sporing af celleafstamning, cellemigrationsstier, generering af 3D-modeller osv.; 2) definition af genekspressionsmønstre; 3) studere cellekulturdynamik, fra gær til humane celler; 4) analysere vævsdynamik eller embryofragmenter; 5) kvantificering af celledødskinetik og opslugning af lig; og 6) udførelse af komparativ fylogenianalyse baseret på embryonale udviklingsmæssige egenskaber. Hvis der er interesse for et af disse emner (eller lignende), kan 4D-mikroskopi bruges.
En af de store udfordringer i moderne biologi er at forstå udviklingen af flercellede organismer. C. elegans har vist sig som en af de bedst egnede modeller til at studere den fine koordinering mellem celleproliferation og celledifferentiering i det udviklende embryo. Fra et optisk synspunkt gør dens gennemsigtige krop og dens lille størrelse denne nematode til en ideel prøve til DIC-mikroskopi. Andre organismer med lignende egenskaber har også været udsat for 4D-mikroskopianalyse 11,12,13,14,15,16.
For disse udviklingsundersøgelser giver geninaktivering ved enten fremadrettet eller omvendt genetik et fingerpeg om dets involvering i embryogenese. Når et gen har vist sig at spille en rolle i udviklingen, er det næste skridt at definere dets nøjagtige rolle i etableringen af den korrekte kropsplan. Immunstaining er den valgte tilgang til de fleste modeller. Denne teknik belyser problemer med celledifferentiering eller ekspression af specifikke markører. En væsentlig begrænsning ved denne tilgang er imidlertid, at den kun giver et statisk billede af udtrykket af en enkelt eller flere markører på et fast punkt i udviklingen. Et dynamisk billede af disse markører gennem hele udviklingen kan kun opnås ved at farve forskellige embryoner på forskellige tidspunkter. Derudover er rekonstruktion af celleafstamning ikke mulig i sådanne faste prøver.
4D-mikroskopi er en komplementær tilgang til at studere embryonal udvikling. Denne teknik afslører udviklingsdynamik ved en celleniveauopløsning. Enhver defekt i embryoet, såsom problemer i spindelorientering, cellemigration, apoptose, celleskæbnespecifikation osv., Vil dukke op i en 4D-film, der kan visualiseres frem og tilbage, kvantificeres og scores af forskeren. Ved hjælp af denne teknik kan stort set hver eneste celle i embryoet følges op til det øjeblik, embryoet begynder at bevæge sig. Embryoner, der udsættes for 4D-mikroskopi med kun synligt lys og Nomarski-optik, pådrager sig ikke fotoskader. Fluorescerende scanninger kan også interkaleres i optagelsen for at detektere, hvornår og hvor et gen udtrykkes. Embryoner, der lider af betydelig fotoskade, identificeres ved cellecyklusforlængelsen, der forårsager stærk UV-bestråling sammenlignet med et standard WT-afstamningsembryo. I så fald kan fotoskader reduceres ved at sænke UV-lampens intensitet og øge kameraets følsomhed eller eksponeringstid. Morfologiske egenskaber og molekylære markører kan hjælpe med at afklare den embryonale udvikling af enhver mutant.
Opsætning af et 4D-mikroskopisystem er let at implementere i laboratoriet og muliggør efter en vis praksis en uovertruffen analyse af celledynamik og afstamningssporing af cellekulturer og levende gennemsigtige prøver på opløsningsniveau for hver eneste celle i mikroskopfeltet. Sporing af celleafstamning på DIC-billeder behandles stadig manuelt. Det er tidskrævende, og selvom softwaren registrerer afstamningsfejl såsom forskellige slægtsgrene, der markerer den samme celle, er fejl mulige. Mens automatisk detektion af GFP-mærkede celler er veludviklet2, er komplementær afstamningssporingssoftware baseret på umærkede celler og billeder af synligt lys stadig i det tidlige stadium og ikke rigtig nyttigt til en fuld embryoanalyse. Uden tvivl vil anvendelse af billedgenkendelsessystemer inden for mikroskopi af synligt lys medføre et stort fremskridt på dette område.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) og den spanske Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda er finansieret af et stipendium fra AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).
Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |